miR-146b-5p异常表达对胰腺癌细胞生物学特性的影响

林凡 王敏 洪晓泉 周伟 王欣 秦仁义

·短篇论著·

miR-146b-5p异常表达对胰腺癌细胞生物学特性的影响

林凡 王敏 洪晓泉 周伟 王欣 秦仁义

MicroRNAs(miRNAs) 是由一类内源性的非编码RNA组成，长度大约20～24 nt，来源于长的前体pri-miRNA和pre-miRNA[1-3]。在多细胞生物体中，它通过不完全碱基互补配对的方式识别靶位点，转录后调控基因的表达[4-5]。尽管过去的几年中通过基因芯片筛查肿瘤特异性miRNA有很大的进展[6]，但miRNA影响肿瘤形成和发展的机制仍不清楚。本研究检测6株胰腺癌细胞miR-146b-5p的表达，观察其对胰腺癌细胞生物学特性的影响。

一、材料与方法

1．细胞培养和转染：人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2、BxPC-3、AsPC-1、PANC1、SW1990、PC-3为同济医院胆胰外科实验室保存，3例正常胰腺组织为胆管肿瘤行胰十二指肠切除术的手术标本。取对数生长期miR-146b-5p表达最低的MIA PaCa-2细胞，采用lipofectamineTM2000将miR-146b-5p mimics和阴性对照miRNA(广州锐博公司)分别转染细胞，按照lipo2000转染试剂盒说明书操作。

2．qRT-PCR检测miR-146b-5p的表达：应用Trizol(Invitrogen公司)提取细胞或组织中的总RNA。分光光度计(Eppendorf BioPhotometer)测RNA的纯度和浓度。应用ReverTra Ace®qPCR RT Kit(FSQ-101，TOYOBO公司) 二步法合成cDNA。应用SYBR®Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO公司)行实时荧光定量PCR。miR-146b-5p茎环状逆转录引物，上、下游引物和内参RNA U6引物均购自广州锐博公司。PCR反应条件：95℃ 3 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min,40次循环。获得的数据运用公式RQ=2-△△Ct的方法计算mRNA表达量。实验重复3次，取均值。

3．MTT法检测细胞增殖：直接在96孔板转染细胞，24、36、48、60、72 h时分别每孔加入20 μl MTT(5 g/L，Sigma公司)继续培养4 h，弃去液体，加入150 μl DMSO，震荡10 min，酶标仪测定各孔490 nm 处的吸光值(A490值)。每个时间点设5个复孔，实验重复3次，取均值。

4．流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期：取转染48 h细胞，消化后用预冷的PBS洗2次，部分细胞用500 μl Binding Buffer 重悬细胞于流式管中，加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC(南京凯基公司)，再加入5 μl PI，混匀后室温避光15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率；部分细胞用PBS重悬，加入两倍体积在-20℃预冷的70%乙醇4℃固定过夜。PBS洗涤2次后加100 μl RNase A，37℃水浴 30 min，再加入400 μl PI混匀，4℃避光30 min，上机检测细胞周期。实验重复3次，取均值。

5．细胞划痕实验检测细胞迁移能力：MIA PaCa-2细胞转染48 h后，用100 μl的消毒枪头进行人工划痕，用无血清培养液洗涤2次去除细胞碎片，倒置显微镜下(Nikon，日本)测量划痕区相对距离。继续培养24 h后，新鲜培养基洗涤2次，镜下观察细胞向划痕区迁移的数目。每组设3个平行孔，每孔随机选取3个视野进行细胞计数。

6．Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力：应用基质胶包被Transwell小室(Corning公司)微孔膜。上室加入用无血清RPMI-1640培养液重悬的转染48 h的MIA PaCa-2细胞200 μl(含10万个细胞)，下室内加入600 μl含20% FBS的RPMI-1640完全培养液。培养24 h后吸去室内液体，用棉棒擦去微孔膜上室面的细胞，甲醛固定15 min，PBS洗2遍后晾干，5 μg/ml DAPI(上海碧云天公司)染色30 min，PBS洗2遍，荧光显微镜下随机选取3个视野计穿膜细胞数。实验做3个小室，取均值。

二、结果

1．6株胰腺癌细胞的miR-146b-5p表达：以3例正常胰腺组织miR-146b-5p的表达均值为对照，U6为内参， MIA PaCa-2、BxPC-3、AsPC-1、PANC1、SW1990和PC-3细胞miR-146b-5p表达量均低于正常胰腺组织，其中以MIA PaCa-2细胞表达最低(图1)。

2．转染后MIA PaCa-2细胞的miR-146b-5p表达：转染48 h后，MIA PaCa-2细胞miR-146b-5p表达量较对照组细胞升高306.5倍。

3．细胞增殖变化：转染 miR-146b-5p的MIA PaCa-2细胞与对照组细胞的生长曲线几乎一致，差异无统计学意义(P>0.05，图2)。

4．细胞周期及凋亡率的变化：转染 miR-146b-5p与对照组MIA PaCa-2细胞的凋亡率和细胞周期差异均无统计学意义(P>0.05，表 1)。

5．细胞迁移和侵袭力的变化：转染miR-146b-5p组MIA PaCa-2细胞的迁移细胞为(36±4 )个，细胞穿膜数为(35±3)个，均较对照组的(165±10)个及(140±9)个显著减少(图3；t=79.00、19.17，P<0.05)。

图1 正常胰腺组织及6株胰腺癌细胞的miR-146b-5p表达

图2 转染组与对照组MIA PaCa-2细胞的生长曲线

表1 两组的细胞凋亡率和细胞周期

图3转染组(a)与对照组(b)MIA PaCa-2细胞的迁移(上)和穿膜细胞(下)

讨论近年来一类长度约为22nt的miRNAs受到了人们的广泛关注，它是一种广泛存在的对基因进行微调的分子，约占人类基因组的1%。miRNAs不直接编码蛋白，其与目的基因结合降解mRNA和(或)抑制其翻译，对细胞的分化、增殖和凋亡等起着极为重要的调控作用[7]。研究表明，miRNAs和肿瘤的发生、发展密切相关，多个miRNA被证实为癌基因和抑癌基因[8]。

Taganov等[9]研究发现，miR-146通过负反馈调节降低IL-1受体相关激酶1、TNF受体相关因子6蛋白水平而抑制天然免疫反应。Hurst等[10]证实，乳腺癌转移抑制因子1(BRMS1)上调miR-146，从而抑制乳腺癌细胞转移。Xia等[11]发现，miR-146b 通过靶向基质金属蛋白酶抑制神经胶质瘤细胞的迁移和侵袭。之前我们应用miRNAs 芯片技术比较了胰腺癌干细胞(CD24+CD44+ESA+)与非干细胞miRNAs表达谱的差异，发现miR-146b-5p在胰腺癌干细胞中的表达显著降低。本研究应用qRT-PCR检测了6株胰腺癌细胞中miR-146b-5p的表达，结果发现，6株胰腺癌细胞miR-146b-5p表达均较正常胰腺组织下调，以MIA PaCa-2细胞的表达最低。

为了明确miR-146b-5p对胰腺癌生物学特性的影响，本研究将miR-146b-5p mimics转染MIA PaCa-2细胞。结果显示，转染miR-146b-5p mimics后，MIA PaCa-2细胞miR-146b-5p表达水平显著升高，细胞增殖能力、细胞凋亡率、细胞周期无明显改变，但细胞迁移和侵袭能力明显降低，表明miR-146b-5p可能对胰腺癌细胞的迁移和侵袭有调控作用。但是miRNAs的作用是协同的，网络式的，将某一个miRNA挑出来研究可能会孤立地片面的看问题。miR-146b-5p不是胰腺癌中惟一异常表达的小RNA分子，所以应该找出更多异常表达的小RNA分子，发现它们之间的联系，以便更好地理解胰腺癌的发生机制。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.020

国家自然科学基金(81071775)

430030 武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科

秦仁义，Email:ryqin@tjh.tjmu.edu.cn

2011-03-03)

(本文编辑：吕芳萍)