玉米种质资源醇溶蛋白的遗传多样性分析

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(1 山西省农科院材料资源研究所，太原 030031；2 山西大学生命科学与技术学院，太原 030006)

玉米种质资源醇溶蛋白的遗传多样性分析

崔永霞1，张海萍1，任元1，张丛卓1，田怀东2，雷柴卫2，张效梅1

(1 山西省农科院材料资源研究所，太原 030031；2 山西大学生命科学与技术学院，太原 030006)

随着分子生物学的发展，蛋白质电泳图谱技术已成为生物多样性研究和材料鉴别的重要手段。本实验对现有的150份特种玉米种质资源，利用SDS-PAGE电泳技术，获得玉米醇溶蛋白的不同电泳谱带(γ、α1、α2、β醇溶谷蛋白组分)，主要表现在三个方面：(1)分子量的高低不同，电泳条带数目不同及相对表达量不同;(2)利用等电聚焦(IEF)电泳法分析了材料间分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，共检测到材料内和材料间13条不同的差异带和特殊带；(3)对其电泳谱带进行聚类分析，将全部供试材料分为6大类，获得了多样的玉米醇溶谷蛋白资源，解析了玉米种质资源种子醇溶谷蛋白的表型特征，揭示了其生化性状的多样性。

玉米；种质资源；醇溶蛋白；电泳图谱；聚类分析

玉米籽粒中蛋白质含量一般在10%左右，其中80%在胚乳中，而另外20%在胚中[1]。醇溶蛋白是玉米中主要的贮藏蛋白,约占所有蛋白的45%～50%[2]。玉米醇溶蛋白具有很强的韧性、疏水性、可降解性、抗菌性等特点,广泛用于食品、医药、纺织、造纸等工业[5,6]。

美国、日本都在玉米醇溶蛋白的利用上加大研究、开发力度，并从玉米淀粉渣中提取了玉米醇溶蛋白[3]。我国对玉米种子蛋白质的研究主要集中在粗蛋白含量、总赖氨酸含量等不稳定的数量性状的测定工作上，在分子水平上还没有系统展开。为此，在种子蛋白质分子的多样性研究中必须充分利用我国丰富的玉米种质资源，为我国走向多样化优质蛋白玉米的育种研究提供理论指导及遗传资源支持。

本研究立足于玉米醇溶谷蛋白解析，并对结果进行聚类分析，从分子水平上揭示我国玉米材料资源的多样性,促进玉米营养品质的育种研究，为特种玉米材料蛋白质的遗传育种学研究奠定基础，以满足玉米籽粒产业的多样化社会需求。

1 材料与方法

1. 1 材料

所选150份玉米材料是保存在山西省农业科学院品种资源研究所种质库内的育种高代品系或具有特殊农艺性状的育种资源品系。其中：早熟普通玉米1～47，共47份；晚熟普通玉米113～143，145～150，共37份；黑糯玉米48～68，共21份；白糯玉米69～73，77～83，100～112，共25份；爆裂玉米74～76，84～88，94～99，144，共15份；黑甜玉米89～93，共5份。

1.2 方法

(1) 表型鉴定。将150份玉米材料进行田间种植、室内考种，鉴定其主要植物学特征、农艺特点；对于种质形态性状(如株高、穗位高、粒形、粒色、轴色、穗行数、行粒数、穗长、百粒重等)进行重复鉴定(重复数次)，并对一些重要的农艺性状(如生育期、抗病性、抗逆性)进行鉴定，将这两类鉴定结果进行初步分类整理[8]。

(2) 提取醇溶蛋白。参照Tian等的方法[9]，提取醇溶谷蛋白。每份材料各取1粒种子,去胚后用研钵磨碎,然后称取研磨后的粉末0.115 g,倒入1.5 mL离心管中,加入300 μL样品提取液在12℃下振荡2 h；14 000 rpm下离心15 min后，在650 μL的上清液中，加入等体积的4℃超纯水，清洗醇溶谷蛋白沉淀，沉淀中加入400 μL的蛋白质溶解缓冲液，所得蛋白质溶液用于SDS-PAGE。

(3) 电泳、染色和照相。使用pH为8.3的电泳缓冲液、8℃的恒温冷却循环水，采用时间分段升压法进行电泳。每个样品上样量为10 μL。在500 V恒压条件下电泳6 h。电泳结束后,使用含有0.1%(w/v)考马斯亮蓝R-250、50%(v/v)甲醇、10%(v/v)乙酸的染色液进行凝胶染色12 h,用蒸馏水冲洗3～5次,使用含有25%甲醇和10%乙酸的脱色液进行凝胶背景脱色直至谱带清晰,统计并拍照保存。

(4) 等电聚焦(IEF)电泳法测定蛋白质的等电点。用IEF样品缓冲液提取分析样品，洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，放上夹条，夹好夹子。配胶、灌胶，待胶凝好后，将塑料垫片底部擦干，放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置放上擦镜纸片，在纸片上加样，盖盖子，横功率25 W电泳，待电流达4 mA以下，停止电泳。取出塑料片，放入固定液中15 min，取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至条带出现即脱色保存。

(5)数据处理。按同一迁移率电泳条带有的记为1,无则记为0来详细记录醇溶蛋白电泳谱带。结果显示,供试的150份材料，迁移率不同的谱带类型13条。然后进行统计，按0∶1的方式将观察到的实验结果记录到计算机上统计成Excel文件。计算材料间的遗传相似系数(GS)。

GS=2Nij/(Ni+Nj)

式中：Ni为材料i中出现的谱带数；Nj为材料j中出现的谱带数；Nij为材料i和材料j中共有的谱带数。

根据遗传相似系数计算出遗传距离(GD)。

GD=1-GS

参考对照材料的标准电泳图谱,形成醇溶蛋白原始数据,用分析软件NT-sys 2.10e进行统计和聚类分析[11，12]。

2 结果与分析

2.1 醇溶谷蛋白的SDS-PAGE结果

采用SDS-PAGE技术，根据蛋白的溶解度和分子量的不同，可将玉米醇溶谷蛋白分为三类：α，β，γ。α醇溶谷蛋白的分子量为21 000～25 000和19 000(Hasting，1984；Wilson，1985b)；β醇溶谷蛋白的分子量为17 000和18 000(Esen,1987)；γ醇溶谷蛋白的分子量为27 000(Esen,1987)。从所选择出的15个材料的醇溶谷蛋白的SDS-PAGE图谱，可以看出γ醇溶谷蛋白的分子量大约为27 000，α醇溶谷蛋白的分子量在21 000～27 000，β醇溶谷蛋白的分子量大约为17 000。使用凝胶成像系统与图像分析软件，分析150份玉米自交系种子醇溶谷蛋白的各组分的组成、分子量等生化性状，发现在电泳凝胶上普通玉米“PC130”自交系的γ，α，β醇溶谷蛋白组分的生化性状与相关文献报道的结果基本一致，其表型特征在所有自交系材料中的发生频度最高(图1)。基于此，“PC130”被确定为对照、用于其它自交系醇溶蛋白各组分的性状表征。

图1 玉米种质资源醇溶谷蛋白的SDS-PAGE1. 对照(PC130)；2.运系98-3；M.分子量标准

图2 γ醇溶谷蛋白带型的多样性1.对照；2.分子量偏低；3.分子量偏高；4.相对表达量高；5.相对表达量低；M.Mark

从电泳图谱图2可以看出，γ醇溶蛋白的差异性主要表现在分子量和相对表达量上。材料2的γ醇溶谷蛋白分子量偏低，材料3的γ醇溶谷蛋白分子量偏高；材料4的γ醇溶谷蛋白相对表达量高，材料5的γ醇溶谷蛋白相对表达量低。

从电泳图谱图3可以看出，β醇溶谷蛋白的差异性主要表现在分子量和相对表达量上。材料6的β醇溶谷蛋白的分子量偏高，材料7的β醇溶谷蛋白分子量偏低；材料8的β醇溶谷蛋白相对表达量少，材料9的β醇溶谷蛋白相对表达量多。

图3 β醇溶谷蛋白带型的多样性1.对照；6.分子量偏低；7.分子量偏高；8.相对表达量高；9.相对表达量低；M.Mark

图4 α1醇溶谷蛋白带型的多样性1.对照；10.一条带；11.两条带；12.集中；13.相对表达量高；M.Mark

从图4和图5可以看出，α醇溶谷蛋白包括α1和α2。α1的差异性主要表现在蛋白条带数的多少与相对表达量上，材料10的α1醇溶谷蛋白有一条带；材料11的α1醇溶谷蛋白有两条带；材料12的α1醇溶谷蛋白集中，材料13的α1醇溶谷蛋白相对表达量高。α2的差异性主要表现在蛋白条带数目上，材料14的α2醇溶谷蛋白有5条带，材料15的α2醇溶谷蛋白有2条带，材料16的α2醇溶谷蛋白有2条带，材料17的α2醇溶谷蛋白有3条带。

图5 α2醇溶谷蛋白带型的多样性14. 5条带；15.两条带；16.两条带；17. 3条带；1.对照;M.Mark

从150份玉米材料的电泳图谱上统计结果表明：玉米材料间醇溶谷蛋白具有丰富的遗传多样性，主要表现在三个方面：分子量的高低不同，电泳条带数目的不同以及相对表达量的不同。

2.2 等电聚焦(Isoelectric focusing，IEF)电泳分析结果

每个材料之间分子量相近，很难区分分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。为了详细解释醇溶谷蛋白的变异，分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分，利用等电聚焦(Isoelectric focusing，IEF)电泳法测定了蛋白质的等电点。等电聚焦(IEF)是一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术，可以分辨等电点(pI)只差0.001 pH单位的生物分子，其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便。如图6所示，150份供试材料中共检测到13条具有不同迁移率的谱带，而且13条变异带在每个材料中以不同的组合、表达量高低和缺失存在，显示出供试玉米材料在醇溶蛋白位点变异丰富，在等位基因水平上具有丰富的遗传多样性。

图6 利用等电聚焦(IEF)电泳法筛选出的13条变异类型

2.3 150份参试玉米材料醇溶蛋白聚类分析

用非加权成对群算术平均法(UPGMA)对150份玉米材料进行聚类分析。将聚类结果与它们的农艺性状进行比较,对实验材料按照形状进行分类，分为：生育期在110 d以下的为早熟普通玉米、生育期在110 d以上的为晚熟普通玉米、白色糯玉米、爆裂玉米、黑色糯玉米和黑甜玉米共6类。同时对各类玉米材料进行分别聚类分析。

2.3.1 早熟普通玉米材料醇溶蛋白聚类分析

早熟普通玉米材料47份，在遗传相似系数为0.56全部聚为一类,遗传相似系数为0.58时聚为三大类。第一类包括42个材料,它们又可划分为2个亚群。第1亚群包含21个材料,第二亚群只有39号材料。第二类只有29号材料。第三类含4个材料，在遗传相似系数为0.67时分成两个亚群，第一亚群包含13，14号材料，第二亚群包含42，43号材料。

2.3.2 晚熟普通玉米材料醇溶蛋白聚类分析

晚熟普通玉米材料37份，在遗传相似系数为0.48时全部聚为一类,遗传相似系数为0.60时聚为三大类。第一类包括34个材料,它们又可划分为2个亚群。第1亚群包含33个材料,第二亚群只有134号材料。第二类包含42，43号2个材料。第三类只有148号材料。

2.3.3 白糯玉米材料醇溶蛋白聚类分析

白糯玉米材料25份，在遗传相似系数为0.49全部聚为一类,遗传相似系数为0.62时聚为三大类。第一类包括29号材料。第二类包括17个材料,它们又可划分为2个亚群。第1亚群包含14个材料；第二亚群包含3个材料，在遗传相似系数为0.74时分成两个亚群，第一亚群只有78号材料，第二亚群包含77，79号材料。第三类含3个材料，在遗传相似系数为0.74时分成两个亚群，第一亚群只有71号材料，第二亚群包含101，104号材料。

2.3.4 爆裂玉米材料醇溶蛋白聚类分析

15份爆裂玉米材料，在遗传相似系数为0.66时全部聚为一类,遗传相似系数为0.72时聚为三大类。第一类包括2个材料,遗传相似系数为0.85时它们又可划分为2个亚群。第1亚群是74号材料,第二亚群是76号材料。第二类含12个材料，在遗传相似系数为0.75时分成两个亚群，第一亚群包含11个材料，第二亚群只有98号材料。第三类是144号材料。

2.3.5 黑糯玉米材料醇溶蛋白聚类分析

21份黑糯玉米材料，在遗传相似系数为0.58时全部聚为一类,遗传相似系数为0.69时聚为三大类。第一类包括17个材料,遗传相似系数为0.79时，它们又可划分为2个亚群。第1亚群包含14个材料,第二亚群在遗传相似系数为0.90时可划分为2个亚类，第一亚类包含49，53号材料，第二亚类只有57号材料。第二类含3个材料，在遗传相似系数为0.79时分成两个亚群，第一亚群包含50，58号材料，第二亚群是66号材料。第三类是62号材料。

2.3.6 黑甜玉米材料醇溶蛋白聚类分析

5份黑甜玉米材料，在遗传相似系数为0.42时全部聚为一类,遗传相似系数为0.51时聚为两大类。第一类是89号材料。第二类包括4个材料，遗传相似系数为0.68时它们又可划分为2个亚群，第1亚群包含3个材料,第二亚群只有92号材料。

3 小结与讨论

(1)利用SDS-PAGE技术系统检测了试供玉米材料的醇溶蛋白谱带，结果表明，150份供试材料的分子量高低不同，电泳条带数目的不同以及相对表达量的不同。

(2)利用等电聚焦(IEF)电泳法共检测到13条具有不同迁移率的谱带,显示出供试玉米材料在醇溶蛋白位点变异丰富，在等位基因水平上具有丰富的遗传多样性。

(3)根据聚类分析可以将全部供试材料分为6大类。选择遗传距离较大的材料作为亲本进行杂交,预期后代将获得较大的超亲分离现象。例如采用遗传距离较远的早熟普通玉米39号材料和13，14号材料杂交，其F1代的产量明显高于13和14号材料杂交的产量。对玉米醇溶蛋白遗传多样性进行分析,也发现其具有丰富的遗传多样性且与材料的来源地有关。对材料进行聚类分析，是研究材料间遗传差异和种质利用的基础，也是杂交育种、亲本选配的重要参考依据。

本试验所选用的150份玉米材料基本上都为具有某些优异特性的资源，可以通过研究发现其中的有益基因，用于指导、辅助育种研究。研究它们之间的遗传关系,明确玉米属种质亲缘关系的远近，对于进一步利用玉米优异特性具有重要意义。根据聚类结果制定系统的育种计划，可以避免推广材料间的遗传背景日趋单一的状况,这也为玉米的高产育种奠定了选择种质资源的理论基础。因此，在甜玉米、糯玉米、爆粒玉米等特种玉米杂交育种中，大规模地调查亲本材料间的遗传背景，有目的有计划地选择遗传距离较远的双亲材料，重视开发利用玉米农家种和野生资源的优良基因，生物技术与常规育种技术有机结合，对于科学组配杂交亲本,加速玉米育种进程有着广阔的应用前景。

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S513.01

A

1001-5280(2012)01--03

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.01.