新疆卡拉库尔羊Fas 基因重组蛋白包涵体的纯化及抗原性分析

潘伊微 贾山岭 潘 辉 贺艳艳 李莲瑞

(1 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔843300)(2 新疆兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔843300)(3 塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

卡拉库尔羊原产于中亚细亚的荒漠、半荒漠草原，是一种耐严寒、酷暑和干旱的大陆性气候的羔皮羊品种，非常适宜在新疆地区养殖。其独特的卷毛在国际市场上享有盛誉，具有良好的经济价值［1］，但近几年大规模、高密度的养殖引起一些严重疾病的出现，对畜牧养殖提出了严峻的挑战。

Fas 属于神经生长因子受体/肿瘤坏死因子受体超家族成员，又称APO－1 或称CD95 分子，是1989年科学家在小鼠体内发现的一种抗体，这种抗体对人类的细胞具有细胞毒性［2－4］。Fas 是一种细胞凋亡信号的受体，因此亦被称为死亡分子。细胞凋亡是指细胞程序性死亡，它能够维持机体的平衡，机体内的细胞凋亡机制若是发生紊乱将会对机体造成极大地损害，目前发现的死亡受体可以分为三大类，Fas 是其中一种死亡受体的代表［5］。

有研究发现，天然表达或转染表达的Fas 基因对细胞凋亡均有促进作用，如一些病毒能够通过诱导T 细胞大量表达Fas，说明Fas 介导的细胞凋亡对T 细胞杀伤和外周T 细胞调控具有重要作用。Fas抗原作为细胞表面受体，其天然配体可能是某种刺激信号，通过信号传导最终诱导细胞凋亡，而Fas 抗体正是模拟了配体的这种作用;另外，Fas 抗原也可能是某种生长因子受体，而Fas 抗体与之结合能阻断其生长因子的作用，因而发生凋亡［6］。这些研究成果很大程度上激发了研究者对细胞凋亡致病机理研究的热情。

目前发现多种病毒对机体免疫系统中Fas的表达均有影响，证明Fas 在免疫细胞的凋亡过程中起着非常重要的作用。随着人类的进步，多种新型病毒引起的传染病在世界范围内迅速传播，进而要求我们在免疫水平，抗病毒水平上有新的发现与突破。Fas 作为细胞凋亡的主要途径之一，理应被重视起来，通过一些分子水平的研究能够帮助我们了解宿主细胞对外来病原微生物的反应机制，从而为我们提供了新的抗病毒策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物、菌株

卡拉库尔羊由塔里木大学动物科学学院试验站提供;宿主菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)保存于新疆塔里木大学动物科学学院实验室。

1.1.2 试剂

低熔点琼脂糖、Tris－Cl、EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、Tris－ 甘氨酸缓冲液，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG 购自博奥森、LB 液体培养基、IPTG、SDS－PAGE 电泳所用试剂、2% NaHCO3、弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂。

1.2 方法

1.2.1 包涵体的提取

将目的基因与表达载体连接转化，挑取重组质粒pET－28a－Fas的阳性菌接种于5 mL 含有Kana(50 μg/mL)的LB 液体培养基中进行过夜培养。将过夜活化后的细菌以1:500的比例加入到含有Kana(50 μg/mL)的200 mL的LB 液体培养基中，225 rpm 振荡培养，适时观察OD600 值，当其达到0.5时，按照表达优化过程中得到的最优条件进行表达。将大量诱导得到的菌液12 000 r/min，10 min，4℃离心后，收集沉积在管底的菌体，用pH8.0的TE buffer 溶解，涡旋混匀后反复冻融4～5 次，超声波破碎菌体。破碎过程中应当注意冰浴，防止温度过高影响提纯效果。破碎完成后收集上清和沉淀。

1.2.2 包涵体上清与沉淀的SDS－PAGE、目的蛋白的浓缩

1.2.2.1 将超声波破碎后收集的上清和沉淀进行SDS－PAGE，经染色脱色后将有目的条带的凝胶与未染色的凝胶比对，将未染色条带对应区域切下。

1.2.2.2 电洗脱 参数设置为电压70 V，时间2 h;将SDS－PAGE 胶从透析袋中取出，封好透析袋并将其放入PBS(pH 7.2)缓冲液中，4℃透析12 h～24 h，期间换3～4 次缓冲液。

1.2.2.3 用PEG8000 浓缩含有目的蛋白透析带，将浓缩后的产物收集到离心管中测定浓度后－20℃保存。

1.2.3 融合蛋白Fas的免疫方法、分离抗血清

用核酸蛋白测定仪测得蛋白浓度为0.1 μg/μL，每隔10 d 对兔子进行一次免疫，免疫所用Fas的强度为120 μg/只。每只兔子的注射量为2.4 mL，乳化过程中的混合物配比为蛋白原液:佐剂=1:1。首免:蛋白原液:弗氏完全佐剂=1:1，乳化4 h，免疫采用两点注射法，免疫部位是兔子的后肢，注射量为，1.2 mL/点。再免:蛋白原液:弗氏不完全佐剂=1:1，乳化4 h，注射方法同首免一样。三免:蛋白原液:弗氏不完全佐剂=1:1，乳化4 h，注射方法同首免一样。为了观察免疫效果［7］，每次免疫前需耳耳缘静脉采血1mL，免疫结束后第10d对其进行心脏采血30 mL，迅速带回实验室离心，将离心后的血清分装于1.5 mL 离心管中，－20℃保存。

1.2.4 重组蛋白的抗血清琼扩实验及Fas的血清IgG的分离

制作浓度为1%的90 mm的琼脂糖平板。用孔径为2 mm 打孔器在琼脂板上打7 个孔。将－20℃保存的血清溶化后倍比稀释，稀释倍数为原液、2、4、8、16、32 倍，将其依次加入圆周上的孔，在圆心中的孔内加入重组蛋白原液，37℃培养24 h。

使用饱和硫酸铵法［10］提取纯化抗重组蛋白Fas的IgG，然后倍比稀释纯化好的抗血清IgG，稀释倍数为原液、2、4、8 倍，然后进行SDS－PAGE 电泳检测。最后再根据Western blotting 对重组蛋白进行分析［11］。

2 结果

2.1 重组蛋白包涵体的纯化

用电洗脱法纯化重组蛋白pET－28a－ Fas 经SDS－PAGE 电泳检测，结果见图1。

图1 重组蛋白包涵体pET－28a－Fas的纯化

2.2 抗血清的抗原性分析

2.2.1 抗血清的免疫原性测定

用琼脂糖扩散试验能够检测抗血清免疫原性，当抗血清稀释到16 倍时仍然可以看到沉淀线，所以抗血清滴度为1:16，结果见图2。

图2 兔抗pET－28a－Fas 倍比稀释血清

2.2.2 兔抗融合蛋白pET－28a－Fas 血清IgG的提取

用饱和(NH4)2SO4法提取纯化可得到的抗融合蛋白pET－28a－Fas 血清的IgG，对其进行SDSPAGE 分析，结果见图3。从图上我们可以看到两条清晰的条带，其分子量大小约为50KDa 和25KDa。

图3 抗融合蛋白pET－28a－Fas IgG

2.2.3 重组蛋白pET－28a－Fas的Western blotting 分析

将SDS－PAGE 电泳后的纯化表达蛋白，转移至NC 膜上，以兔抗的阳性血清为一抗，以HRP 偶联羊抗兔的IgG 为二抗，底物使用联苯胺，进行蛋白质印迹分析，重组质粒阳性菌表达产物能够与兔抗羊阳性血清发生反应，这一现象表明蛋白质具有抗原性。结果见图4。

图4 表达蛋白pET－28a－Fas的Western blotting 鉴定

3 讨论

本实验将包含有卡拉库尔羊Fas 基因的序列克隆到了原核表达载体pET－28a 中，使用IPTG 进行诱导使Fas 重组蛋白在表达宿主菌中成功表达，利用正交分解法设计平行试验组对表达条件进行优化，最终将融合蛋白表达量提高到了15.6%。其分子量大小为为39.7KDa。

实验中的原核表达系统采用的表达方式是融合蛋白表达。这种表达方式可利用亲和层析的方法来检测和纯化目的蛋白，其次防止目的蛋白被宿主细胞蛋白酶降解。

经过可溶性分析发现本实验中的Fas 主要以包涵体的形式存在。大量不溶性蛋白和RNA 凝聚会形成包涵体，它包含了大部分目的蛋白。包涵体的优点在于其能够保护目的蛋白不被水解，其次不用担心破碎细胞过程中高温导致的蛋白质变性，再次能够通过离心收集较纯的目的蛋白［12］。同时包涵体也存在着一些问题，这主要体现在包涵体的不溶与无活性两个方面，这都会给纯化工作造成麻烦。

抗原刺激机体产生免疫应答的能力被称为抗原性，其强弱不仅与抗原分子的结构有关，同时也与免疫动物亲缘关系有关系。抗原性可分为免疫原性和反应原性，反应原性指抗原能与其刺激产生的致敏淋巴细胞或抗体发生反应［13］。

本试验利用琼扩实验和蛋白质印迹法证明了融合蛋白pET－28a－Fas 是一种完全抗原，具有较好的免疫原性和反应原性。

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