天然和热处理大豆蛋白稳定乳液的性质研究

王金梅 夏 宁，2 杨 娟 杨晓泉

(华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白中心1，广州 510640)

(广西大学轻工与食品工程学院2，南宁 530004)

天然和热处理大豆蛋白稳定乳液的性质研究

王金梅1夏 宁1，2杨 娟1杨晓泉1

(华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白中心1，广州 510640)

(广西大学轻工与食品工程学院2，南宁 530004)

热处理(90、120℃)修饰的大豆分离蛋白用于制备水包油(O/W)乳液，并对天然和热处理蛋白乳液的粒径、微结构、絮凝率和分层稳定性进行表征。热处理蛋白的水力学半径随蛋白浓度和加热温度的增加而增加，证实了可溶性聚集体的产生。乳液粒径和分层稳定性受离子强度、聚集体粒径影响。低离子强度下(0 mmol/L)，与天然蛋白相比，热处理蛋白乳液粒径较大，20 d放置后未发生分层。离子强度的增加(100 mmol/L)导致天然蛋白乳液粒径明显增大;而热处理蛋白乳液则表现出较高耐盐性，体现在更小的粒径、絮凝率和分层指数。与90℃热处理相比，120℃热处理减小了乳液液滴的粒径和絮凝。

大豆蛋白 热处理 蛋白聚集 乳化活性 乳液稳定性

蛋白质具有两亲性质，常被作为乳化剂广泛应用于乳液体系中。通常认为，蛋白通过在油水界面上的吸附降低界面自由能，在液滴表面形成具有一定强度的凝胶化界面层来维持乳液的稳定［1］。但在加工过程和货架期内会发生液滴间的相互作用，随之出现液滴的絮凝和聚结，进而引起脂肪上浮、蛋白沉淀、质感粗糙等失稳现象，严重影响了乳液的质构特性及口感［2］。蛋白结构性质(分子尺寸、分子柔性、表面疏水性等)与环境因素(离子强度、pH等)强烈影响蛋白的乳化性质，且液滴尺度、连续相黏度和絮凝物的尺度和结构等因素影响乳液稳定性(特别是分层稳定性)［3］。

热处理是食品加工中不可缺少的处理操作，如热杀菌，已广泛用于修饰蛋白的结构、理化和功能性质。高于蛋白变性温度的热处理诱导了球蛋白的部分展开，伴随着大分子质量聚集体的形成。聚集程度受蛋白浓度，处理温度等因素影响。热诱导的结构破坏使分子内部的疏水基团暴露于分子表面，增强了蛋白的界面活性［4］。依据蛋白结构展开和聚集体尺寸不同，热处理不同程度的影响了蛋白的起泡性和泡沫稳定性［5］。目前，热变性蛋白稳定乳液的研究相对较少［5］。研究证实，热处理可以改善乳清蛋白的乳化活性和乳液稳定性［6］。

大豆蛋白因具有良好的营养价值和功能性质已广泛用于食品体系中。如何修饰大豆蛋白结构来改善其功能性质备受研究者关注。目前，用来修饰大豆蛋白结构的热处理基本低于100℃。95℃热处理可以有效的提高大豆蛋白的乳化能力及乳液冻融稳定性［7－8］，但研究未考察蛋白聚集对乳化能力的影响。最近，喷射蒸煮热处理(120℃)被证实可以明显改善醇/热变性大豆蛋白的溶解性，并明显提高蛋白的乳化活性［9－10］。基于此，本试验对不同浓度的大豆分离蛋白溶液进行热处理(90、120℃)，形成具有不同聚集程度的变性蛋白，并对不同离子强度下(0、100 mmol/L)，天然和热处理蛋白乳液的粒径、微结构、絮凝率和分层稳定性进行表征和分析，以期为功能性大豆蛋白的加工生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

低温脱脂豆粕:山东禹王公司;尼罗红和尼罗蓝:Sigma公司;牛血清白蛋白:北京鼎国试剂公司;金龙鱼玉米油:市售;其他试剂均为分析纯。

手提式高温灭菌锅:上海三申医疗器械有限公司;CR22G型冷冻离心机:日本HITACHI公司;Dumas定氮仪:法国Elementar公司;T25高速剪切机:德国IKA公司;M－110EH－30高压微射流纳米均质机:美国MFIC公司;Nanosizer粒度分布仪、Mastersize2000粒度分布仪:英国Malvern公司;激光共聚焦显微镜:德国Leica公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆分离蛋白的制备及热处理

采用碱溶酸沉方法制备大豆分离蛋白(SPI)，以料液比1∶10向低温脱脂豆粕加入纯水，调至pH 8.0，室温搅拌2 h后10 000×g离心20 min。将上清液调至pH 4.5进行酸沉，经过离心 (10 000×g，10 min)后的蛋白沉淀重新溶于纯水中，调至pH中性后进行透析、冻干。由Dumas方法测得SPI的蛋白质量分数为(85.79 ±0.70)%(N × 5.71)。

称取一定量SPI溶于浓度5 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)至设定的蛋白质量浓度(1～6 mg/mL)，室温搅拌2 h后密封于带盖瓶中进行热处理(90、120℃，20 min)，其中，90℃热处理采用水浴方式，120℃热处理采用高温蒸汽灭菌方式进行。热处理后，样品迅速冷却备用。

1.2.2 蛋白的水力学半径

采用动态光散射技术(DLS)测定天然和热处理SPI的平均水力学半径。使用5 mmol/L磷酸缓冲液将样品溶液稀释至1 mg/mL，经0.22 μm滤膜过滤后置于样品池。背散射技术(光散射角度为173°)用于降低灰尘的影响。通过检测光散射强度随时间变化计算自相关函数，根据斯托克斯－爱因斯坦方程计算出平均水力学半径(Rh)。

1.2.3 乳液的制备

将一定量天然和热处理SPI与玉米油混合，调节混合物的离子强度至设定值(0、100 mmol/L)，并加入0.02%叠氮钠抑制微生物生长。常温下，混合物经预乳化(5 000 r/min，2 min)后进行微射流处理二次(50 MPa)，制备成蛋白质量分数为0.5%，油含量为10%的乳液。

1.2.4 乳液粒度的测定

采用Mastersizer 2000粒度分布仪测定乳状液滴的粒径大小。参数设置为:颗粒折射率:1.520;颗粒吸收率:0.001;分散剂:水;分散剂折射率:1.330。试验采用d43，即体积平均直径表征液滴粒度的大小。乳液的絮凝率(FD)=(d43－d43SDS)/d43SDS×100%［10］，其中 d43SDS为加入 SDS 所测得的 d43。

1.2.5 乳液的微结构观察

采用激光共聚焦方法观察乳液的微结构。1 mL样品中加入混合染料40 μL(0.02%尼罗红和0.1%尼罗蓝混合液)，充分混合均匀。样品固定于激光共聚焦显微镜载物台上，物镜(×100)观察之后初调聚焦平面。选择488 nm的Ar离子和633 nm的He/Ne离子激光预扫描，采集荧光图像，扫描密度为1 024×1 024。使用LAS AF Lite软件进行图像处理。

1.2.6 乳液的分层稳定性

取10 mL新鲜乳液至乳析管中，置于室温，定期测量乳状液分层后样品底部清液层的高度。乳液的分层指数=清液层高度(HS)/样品的总高度(HT)×100%。

2 结果与讨论

2.1 热诱导大豆蛋白聚集体的形成

差示热量扫描量热仪(DSC)测定蛋白变性程度的结果显示，90、120℃热处理均使SPI发生完全变性(数据未列出)。高于变性温度的热处理诱导大豆蛋白去折叠和聚集的发生已被广泛认识。首先，应该指出，低离子强度下的热处理未对蛋白溶解度产生明显影响，即未生成不溶性聚集体(数据未列出)，这可能与β－伴大豆球蛋白抑制大豆球蛋白不溶性热聚集体的形成有关［11］。天然和热处理蛋白的水力学半径(Rh)用来评价可溶性聚集体的尺度，见图1。热处理蛋白的Rh高于天然蛋白，且随蛋白质量浓度增加而增加，说明蛋白聚集现象的发生。120℃热处理导致蛋白粒径进一步增加，表明较高温度处理利于大尺度聚集体的形成。

图1 天然和热处理大豆蛋白的水力学半径(Rh)

2.2 乳液液滴粒度及微结构

基于蛋白结构决定其功能性质的认识，热处理修饰的大豆蛋白可能具有不同的乳化能力。蛋白乳液的液滴粒径和微结构用于评价蛋白聚集对乳液性质的影响。图2为天然和热处理蛋白乳液的体积平均直径d43。在0 mmol/L下，天然蛋白表现了最低的d43，蛋白的热处理增加了乳液的粒径。90℃热处理蛋白乳液的d43随着蛋白浓度的增加而逐渐增加，而120℃处理蛋白乳液的d43不依据蛋白粒径的增大而变化，且始终低于90℃热处理蛋白(图2a)，说明120℃热处理蛋白拥有较高的乳化性。这可能与蛋白在油水界面上的较易吸附有关。

图2 不同离子强度下天然和热处理蛋白乳液的液滴粒径大小(d43)

理论上理解，蛋白的热处理导致大量疏水基团的暴露，使蛋白分子与水的不相容性增强，进而增强了蛋白的乳化能力。这与乳液粒径结果不一致，热处理蛋白中可溶性聚集体的出现可能与之相关。高压均质乳化时，乳化剂减小界面张力和抑制油滴的重新聚结的能力决定了液滴的粒径大小［12－13］。有报道称［14］，由于大粒径分子具有较高的对流传质速度，高压均质时产生的巨大湍流可以促进蛋白聚集体在界面上优先吸附。之后，由于聚集体的空间位阻作用，导致蛋白分子不能很好的覆盖油滴，阻止油滴的重新聚结，最终表现为较大的液滴粒径［12－13］。研究报道，蛋黄的热处理也导致了乳液粒径的增加。乳液液滴粒径的温度依赖性(90、120℃)可能与不同蛋白结构变化和分子重排有关［12－13］。

蛋白乳液的粒径受离子强度强烈影响。一般认为，离子强度的增加通过改变蛋白分子表面的电荷来改变蛋白在油水界面的吸附，进而影响乳化效果。同时，盐离子对乳液液滴表面电荷的屏蔽可能加速液滴之间的絮凝。NaCl的加入(100 mmol/L)使天然和热处理蛋白乳液的粒径明显增大，其中天然蛋白乳液呈现了最大的d43值，而热处理蛋白乳液拥有较低的液滴粒径，特别是120℃热处理修饰的蛋白，这个蛋白乳液粒径受聚集程度影响较小(图2b)。这些结果说明了蛋白的热处理明显提高了乳液的离子强度耐受性，特别对于较高温度(120℃)热处理而言。

CLSM技术用于直观观察乳液的微结构，见图3。在0 mmol/L离子强度下，天然和热处理蛋白都形成了稳定均一的乳液体系，体积分布集中于0.1～2 μm。与天然蛋白相比，热处理蛋白乳液出现了较大粒径的油滴。90℃热处理蛋白乳液的油滴大小随着蛋白聚集程度的提高而变大，大粒径分布峰的出现同样证实了乳液粒径的增加。120℃热处理蛋白乳液出现较小的液滴。上述结果与液滴粒径变化一致(图2a)。值得注意的是，100 mmol/L下，天然蛋白乳液的共聚焦图片中出现了更大尺度的油滴，且油滴大小不均一，同时伴随着一定程度絮凝的发生。对于热处理蛋白乳液，大片的液滴絮凝出现在视野中，且液滴之间存在大范围的黑色区域，表明液滴之间发生了强烈的桥联絮凝，但仍可见较小尺度的油滴絮凝在一起并未发生强烈的聚结现象，即大尺度油滴的形成。

图3 在不同离子强度下天然和热处理蛋白乳液的CLSM图片

由乳液微结构可知(图3)，100 mmol/L离子强度下，天然和热处理蛋白乳液液滴间发生了强烈的絮凝。乳液的絮凝率用于定量评价不同样品絮凝的差异，见图4。热处理蛋白乳液的絮凝率明显小于天然蛋白，且随加热温度增加而略微减小，随蛋白浓度的增加变化不明显。通常认为，蛋白乳液絮凝主要由液滴界面层上发生的吸引和排斥相互作用所控制。提高液滴的抗絮凝能力可以通过增强液滴间的静电和空间排斥来实现［12］。目前已知，高于蛋白变性温度的热处理诱导了蛋白去折叠，随之发生的蛋白表面疏水性的增加提高了蛋白的界面活性，增加了其在界面的吸附。有报道证实大豆乳液液滴间的蛋白聚集体在乳化时可以吸附到界面上，增加了界面蛋白吸附量［15］，由此产生的空间排斥在一定程度上抑絮凝，使乳液对外界环境不敏感。

图4 100 mmol/L离子强度下天然和热处理蛋白乳液的絮凝率

2.3 乳液分层稳定性

乳液液滴间的絮凝、聚结会加速乳液的分层，样品底部出现透明的水析层。在0 mmol/L下，乳液经室温静置20 d后，未出现明显的分层现象，说明了良好的乳液稳定性。图5为100 mmol/L下，天然和热处理蛋白乳液的分层指数随放置时间变化的情况。新鲜制备的天然蛋白乳液未发生明显乳析，室温放置12 h后慢慢出现脂肪上浮，且随储藏时间延长而逐渐增加，放置20 d后，分层指数高于60%;热处理蛋白乳液在制备后30 min就出现明显的乳析现象，室温放置2 d之内迅速增加，最终分层指数明显小于天然蛋白乳液。热处理改善分层稳定性涉及的机理可能是，天然蛋白乳液形成的絮凝物是以开放的结构存在，水分子包裹其中，而热处理蛋白乳液液滴可以自由的环绕彼此，进而更紧密的结合在一起，在油滴表面形成牢固紧密的结构，一定程度上抑制了乳液的分层。热变性蛋黄的乳化性质研究结果支持了这一推断［12－13］。另外，最初乳液分层速度随蛋白聚集程度增加(蛋白浓度增加)而增加，且120℃热处理表现了更小的分层速度(数据未列出)，但放置后未发现分层指数的差别。本试验未发现乳液絮凝率与分层速度之间的相关性。

图5 100 mmol/L离子强度下天然和热处理蛋白稳定乳液的分层指数变化

3 结论

大豆蛋白的热处理诱导了可溶性聚集体的生成，且聚集体粒径受蛋白质浓度、加热温度影响。在不同离子强度下，蛋白聚集程度影响了乳液的粒径、微结构和分层稳定性。在0 mmol/L下，热处理蛋白乳液的液滴粒径较天然蛋白轻微增加，无明显絮凝发生，长期放置无明显分层。在100 mmol/L下，天然蛋白乳液出现大尺度的液滴，而蛋白的热处理显著减小了乳液的絮凝率，证实了其具有较强的盐耐受性，特别对于120℃热处理而言。热处理蛋白乳液制备后快速分层，形成结构紧密的絮凝体，明显改善了乳液的分层稳定性。这些理解将有利于拓展热处理蛋白在真实乳液食品体系中的应用。

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Characterization of Oil－in－Water Emulsion Stabilized by Native and Heat－Treated Soy Protein

Wang Jinmei1Xia Ning1，2Yang Juan1Yang Xiaoquan1
(College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology1，Guangzhou 510640)
(Department of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University2，Nanning 530004)

Heat treatments(90 and 120 ℃)were used to modify the emulsifying properties，and the droplet size，microstructure，and creaming stability of emulsion stabilized by native and heat－ treated proteins were investigated and compared.Upon heat treatment，the hydraulic radius of protein gradually increased with increasing protein concentrations and heating temperature due to the formation of soluble aggregates.The droplet size and creaming stability of emulsion depended on ionic strength and degree of protein aggregation.At low ionic strength，heat－ treated protein emulsion had higher droplet size as compared to native protein emulsion，without creaming after 20 day storage.The addition of salt(100 mmol/L)resulted in the increase in droplet size of emulsion，especially native protein emulsion.However，emulsion stabilized by heat－ treated SPI exhibited a decreased salt sensitivity，as evidenced by lower droplet size，flocculation degree，and creaming index.Compared to heat treatment at 90 ℃，higher heating temperature(120℃)slightly decreased the droplet size and flocculation degree of emulsion.

soy protein，heat treatment，protein aggregation，emulsifying ability，emulsion stability

TS201.1

A

1003－0174(2012)09－0016－05

国家自然科学基金(21076087)

2011－12－22

王金梅，女，1982年出生，博士，植物蛋白加工与利用

杨晓泉，男，1965年出生，教授，博士生导师，植物蛋白加工与利用