中性蛋白酶对腊牛肉加工中蛋白质影响的研究

穆建稳，董全，李洪军

（1.贵州省六盘水市钟山区科技局，贵州 六盘水 553000；2.西南大学食品科学学院，重庆 400716）

中性蛋白酶对腊牛肉加工中蛋白质影响的研究

穆建稳1，董全2，李洪军2

（1.贵州省六盘水市钟山区科技局，贵州 六盘水 553000；2.西南大学食品科学学院，重庆 400716）

在腊牛肉腌制中，将中性蛋白酶按原料肉重的0.010%、0.015%、0.020%、0.025%和0.030%的添加量掺入腌制剂中腌制7 d，发现肉中非蛋白氮含量和氨态氮含量随着腌制天数的增加而大幅度增加，表明在此期间，肌肉蛋白质在酶的作用下发生了强烈降解。降解程度随着酶添加量增大而提高。

腊牛肉；中性蛋白酶；蛋白质

腊牛肉(牛干巴)是我国西南地区独具特色的以牛肉为加工原料的半干肉制品，加工历史悠久，风味独特，深受当地各族人民的喜爱[1]。国内对腊牛肉的研究以及相关的研究报告极少，从现有的报道来看也多是从加工过程中微生物区系及其变化对产品质量特征及风味的关系进行研究[2-3]，而通过引入酶制剂缩短腌制时间，加速其成熟的研究鲜见报道。研究腊牛肉加工过程蛋白质的变化及其特点，酶制剂对腊牛肉加工过程中蛋白质变化及感官评价的影响，从而为腊牛肉生产的标准化及工业化，解决传统腊牛肉生产加工周期长、生产受季节限制、产品质量不稳定等影响其发展的问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜牛后腿肉；中性蛋白酶（20万U/g）：由广西南宁庞博生物工程有限公司提供。

1.2 主要仪器与设备

微量凯氏定氮装置、10 mL微量滴定管：重庆北碚特种玻璃仪器厂；PHS-3C型精密酸度计：上海大普仪器有限公司；FA2004A电子分析天平：上海精天电子仪器厂；TGL-18C高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；BL301A4多功能食品粉碎机：上海赛康电器有限公司。

1.3 分析测定方法

1.3.1 挥发性盐基氮测定（半微量凯氏定氮法[4]）

将除去脂肪、骨、腱后的样品切碎搅匀，准确称取10 g置于锥形瓶中，加100 mL蒸馏水，不时振摇，浸渍30 min。过滤，取滤液备用。

将盛有10mL硼酸吸收液（20g/L）并加有5滴～6滴混合指示剂（2 g/L甲基红乙醇溶液和1 g/L次甲基蓝水溶液用前等量混合）的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，吸取5.0 mL上述样品滤液于蒸馏器的反应室内，加5 mL MgO悬浊液（10 g/L），迅速盖塞，并加水以防漏气。通入蒸汽进行蒸馏，由冷凝管出现冷凝水时开始计时，蒸馏5 min。吸收液用0.01 mol/L HCl标准溶液滴定，记录消耗量（V1）。同时做空白试验（V0）。结果用下式计算：

式中：TVB-N为试样中挥发性盐基氮的含量，（mg/100g）；V0为试剂空白消耗盐酸标准溶液体积，mL；V1为测定用样液消耗盐酸标准溶液体积，mL；0.01为盐酸标准溶液的浓度，（mol/L）；14为与1.00 mL盐酸标准滴定溶液相当的氮的质量，mg；m为试样质量，g。

计算结果保留3位有效数字。

1.3.2 氨基酸态氮的测定（甲醛滴定法[4]）

准确称取10 g样品绞碎研磨，于100 mL容量瓶加水定容，浸提1 h，过滤吸取20 mL上清液于烧杯，加60 mL蒸馏水，开动磁力搅拌器，用0.05 mol/L NaOH标准溶液滴定至pH 8.20，加入10 mL甲醛溶液，混匀。再用0.05 mol/L NaOH标准溶液滴定至pH 9.20，记录消耗标准溶液的体积（V1）同时做空白试验（V0）。结果用下式计算：

式中：AN为试样中氨基酸态的含量，（g/100 g）；V0为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V1为测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；0.05为氢氧化钠标准溶液的浓度，（mol/L）；0.014为与1.00 mL氢氧化钠标准溶液相当的氮的质量，g；m为试样质量，g。

计算结果保留三位有效数字。

1.3.3 总氮、蛋白氮与非蛋白氮的测定

1.3.3.1 总氮的测定

凯氏定氮法，GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》。

1.3.3.2 蛋白氮与非蛋白氮的测定[4]

准确称取样品2 g置于750 mL凯氏烧瓶中，加水50 mL，再加入几粒玻璃珠和1滴～2滴硅酮消泡剂。将混合物徐徐煮沸，消化0.5 h。趁消化液尚热时，加入2 mL硫酸铝钾溶液（100 g/L）摇匀后重新加热至恰好沸腾。加入50 mL醋酸铜溶液（30 g/L），充分混合，冷却后过滤，用50 mL冷水洗涤烧瓶及沉淀。

（A）测定蛋白氮时，将滤纸和沉淀放回原烧瓶中，按1.3.3.1方法测定氮含量。（B）测定非蛋白氮时，将滤液转入另一清洁的凯氏烧瓶中，按1.3.3.1方法测定氮含量。

1.4 试验方法

1.4.1 工艺流程

新鲜牛肉→切块→称重→腌制→冲洗→晾挂→烘烤干燥→冷却→真空包装→成品

1.4.2 酶在腌制过程中对蛋白质变化的影响

将中性蛋白酶按不同添加量掺入根据预备试验最佳配方的腌制剂中，在4℃条件下腌制7 d，每24小时取样进行非蛋白质氮、氨基酸态氮、挥发性盐基氮测定。酶的种类及添加量见表1。

表1 酶制剂种类及添加量表Table 1 Enzymatic preparation species and adding dosage

2 结果与分析

2.1 酶在腌制中对非蛋白质氮含量变化的影响

目前国内在肉类工业上主要用之进行肉的嫩化、蛋白水解提取水解产物等。在应用中发现用蛋白酶进行肉的嫩化及水解时，容易造成肉质地软糊并产生腐臭味和水解物中苦味肽较多[5]，因此应控制其用量及水解程度。

非蛋白质态氮是由多肽，小肽，氨基酸等一些小分子的含氮物质组成的，是风味物质的重要前体物质，对肉制品的风味有重要影响[6]。中性蛋白酶在腌制过程中对非蛋白质氮含量的影响见图1。

图1 中性蛋白酶在腌制中对非蛋白质氮含量的影响Fig.1 The effect of neutral protease to content of NPN during the curing processing

从图1可以看出，经过7 d的腌制，样品中非蛋白质态氮的含量随着添加量的增加也迅速提高，0.010%添加量使非蛋白质氮含量从腌制时的1.39%增加到1.82%，与腌制前相比提高了30.94%；0.02%添加量使非蛋白质氮含量从1.35%增加到1.97%，与腌制前相比提高了45.93%；0.030%的酶使含量从1.37%增加到2.23%，与腌制前相比提高了62.77%。

2.2 酶在腌制中对氨态氮含量变化的影响

氨基酸不仅是肉制品风味物质的重要前体物质，它本身也对肉制品的滋味有重要影响，不同的氨基酸呈现不同的味道，甘氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬氨酸具有甜味作用；精氨酸、组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、胱氨酸具有苦味作用；丝氨酸和谷氨酸具有鲜味作用[7]。除了对滋味的贡献外，游离氨基酸也是一些挥发性香味物质的前体。如来源于缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸Strecker降解的2-甲基丙醛，2-甲基丁醛，3-甲基丁醛、含硫化合物、吡嗪，以及来源于蛋氨酸、半胱氨酸和还原糖发生美拉德反应产生的呋喃类化合物[7]。可见肉制品中氨基酸的种类与含量对肉品的风味至关重要。

中性蛋白酶在腌制中对氨基酸态氮含量的影响见图2。

图2 中性蛋白酶在腌制中对氨基酸态氮含量的影响Fig.2 The effect of neutral protease on the content of AN during the curing processing

从图2看出在7 d的腌制过程中样品的氨态氮含量在酶的作用下呈现总体上升趋势，趋势随酶量增加而增强，在以原料肉重0.010%的添加量下，氨态氮的含量从0.0803%增加到0.090%，与腌制前相比提高了12.08%；在0.020%的添加量下氨态氮含量从0.081%增加到0.103%，与腌制前相比提高了27.65%；在0.030%的添加量下氨态氮含量从0.0822%增加到0.122%，与腌制前相比提高了48.66%。

2.3 酶在腌制中对TVBN含量变化的影响

挥发性盐基氮是蛋白质在酶和微生物的作用下发生分解产生的氨及胺类物质，也是评价肉及肉制品鲜度的主要卫生指标，它的含量在一定程度上标志着肉及肉制品的腐败程度。

图3 中性蛋白酶在腌制中对TVBN的影响Fig.3 The effect of neutral protease on the content of TVBN during the curing processing

中性蛋白酶在腌制中对挥发性盐基氮的影响见图3。可知，在腌制7 d后样品中挥发性盐基氮含量都有较大程度的提高，其中添加了0.030%（原料肉重）的挥发性盐基氮含量超过了15 mg/100 g，但通过对气味及颜色的观察并没有明显的腐败变质特征。而这种现象在我国传统肉制品如火腿、腊肉中均发现在腌制阶段及后熟、贮藏过程中挥发性盐基氮的含量都随着时间的延续而增加[8-9]。由此表明，在腊牛肉（牛干巴）中加入酶制剂使TVBN含量明显增加，但这种增加在短期的腌制时间内不足以引起肉品的腐败。而且蛋白质降解所产生的复杂产物恰好赋予了腊牛肉（牛干巴）独特的风味。

3 结论

在腊牛肉（牛干巴）腌制中，中性蛋白酶以原料肉重的0.010%、0.015%、0.020%、0.025%和0.030%的添加量掺入腌制剂中腌制7 d，发现肉中非蛋白氮含量和氨态氮含量随着腌制天数的增加而大幅度增加，表明在此期间，肌肉蛋白质在酶的作用下发生了强烈降解。降解程度随着酶添加量增大而提高。

在腌制中挥发性盐基氮含量有较大程度的提高，其中添加了0.030%（原料肉重）中性蛋白酶的挥发性盐基氮含量超过了15 mg/100 g，但通过对气味及颜色的观察并没有明显的腐败变质特征。表明在腊牛肉加工过程中加入中性蛋白酶致使TVBN含量明显增加，但这种增加在短期的腌制时间内不足于引起肉品的腐败。而且蛋白质降解所产生的复杂产物恰好赋予了腊牛肉独特的风味。

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Study on Effect of Neutral Protease to Protein in the Processing of Dry-Cured Beef

MU Jian-wen1,DONG Quan2,LI Hong-jun2

（1.Science and Technology Department of Zhongshan District,Liupanshui 553000,Guizhou,China;2.College of FoodScience,South-west University,Chongqing 400716,China）

In the process of salting Dry-cured Beef,add neutral protease in the proportion of 0.010%,0.015%,0.020%,0.025%and 0.030%of the beef and salt the beef for 7 d.The experiment shows that the contents of NPN and AN be increased greatly with the increase of the salting days.It shows that the Muscle protein degrades because of the chemical reaction with enzyme.The degradation degree rises with the increase of enzyme.

dry-cured beef;protease;protein

穆建稳（1969—），男（汉），工程师，硕士，主要从事农产品贮藏与加工研究与应用推广工作。

2011-12-18