高效液相色谱法测定茶叶中五种水溶性维生素

郭玉华，郁有祝

（安阳工学院化学与环境工程系，河南 安阳 455000）

高效液相色谱法测定茶叶中五种水溶性维生素

郭玉华，郁有祝

（安阳工学院化学与环境工程系，河南 安阳 455000）

用高效液相色谱（HPLC）梯度洗脱法测定茶叶中的5种水溶性维生素成分和含量，结果表明，样品经XDB-C18柱分离，使用紫外检测器（波长266 nm），流动相为甲醇与0.03 mol/L KH2PO4（pH＝6.1）混合，梯度洗脱，样品中5种水溶性维生素得到良好分离，该5种水溶性维生素标准曲线相关系数均达0.9990以上，平均回收率为84.5%～102.7%，变异系数RSD<5.4%。测得普洱茶中VC的含量为14.37 mg/100g，VB1的含量为2.17 mg/100 g，VB6的含量为1.58 mg/100 g，VB2的含量为3.47 mg/100 g，叶酸含量为1.34 mg/100 g；信阳毛尖中VC的含量为11.69 mg/100 g，VB6的含量为1.76 mg/100 g，VB2的含量为8.12 mg/100 g，叶酸含量为9.66 mg/100 g，未检出VB1。

高效液相色谱；水溶性维生素；茶叶

茶叶作为传统饮料，含有丰富的蛋白质、氨基酸、生物碱、茶多酚、糖类、有机酸、芳香物质、水溶性矿物质和多种水溶性维生素。茶叶备受人们的喜欢且长盛不衰，除了客观原因以外主要取决于它的自身价值和一定的药理作用。茶对人们的养生、保健、以及疾病防疫等都有一定的功效。

水溶性维生素常用的测定方法[1]有：紫外分光光度法、荧光法和高效液相色谱法，此外还有毛细管电泳法[2]。紫外分光光度法干扰比较严重，一般需要经过适当的前处理，且很难找到一种显色剂能够同时测定，因此不适于多组分同时测定。荧光法测定维生素的灵敏度高，但线性范围窄，适合含量较低的维生素测定。高效液相色谱法因处理样品简单、快速，且能同时测定几种维生素而被广泛应用于食品[3-5]、药品[6]中维生素的测定。本论文对色谱条件进行了优化，并进行了方法学评价，在优化的色谱条件下对普洱茶和信阳毛尖中的5种水溶性维生素含量进行了测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent l200型高效液相色谱仪：美国Agilent科技有限公司，配紫外检测器；维生素标准品：上海融禾医药科技发展有限公司，纯度＞98%；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

1.2 维生素标准储备液的配制

用电子天平准确称取一定量的VC﹑VB1﹑VB6﹑VB2、烟酸，用新配制的0.1 mol/L的盐酸溶解后定容配成一定浓度的标准储备液。叶酸则以少量稀KOH溶解后，再用0.1 mol/L的盐酸定容配成一定浓度的标准储备液。使用前，根据需要以0.1 mol/L的盐酸稀释成指定浓度的标准工作液。

1.3 样品处理

用烘箱将茶叶低温烘干（温度不要超过60℃），然后用研钵研碎，用电子天平准确称取一定量的毛尖和普洱茶，用0.1 mol/L的盐酸浸泡，用超声清洗器振荡30 min，再在70℃的恒温箱中水浴30 min后，取上层清液，加入饱和的醋酸铅溶液，混匀后静置，取上层清液过滤，备用。

1.4 色谱条件

色谱柱：XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；

采用梯度洗脱：流动相A为0.03 mol/L KH2PO4（pH＝6.1），B 为甲醇，从进样时 90%的 A 经 10 min线性变化为50%的A；流速为1.0 mL/min；检测波长为266 nm。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相及梯度洗脱条件

本研究采用甲醇/缓冲溶液体系梯度洗脱[4]，测试了流动相A和B在梯度起始和结束时不同组成比例下的洗脱状况，试验结果表明：当采用流动相体系A为 0.03 mol/L 磷酸二氢钾（pH＝6.1），B 为甲醇，从进样时90%的A经10 min线性变化为50%的A时，6种维生素分离情况较好，在12 min内出峰完全（见图1c）。

2.1.2 流动相中缓冲液pH对分离效果的影响

水溶性维生素在水中易产生电离，电离后的离子在反相柱中的保留时间较短，不利于分离。试验中通过调节流动相中KH2PO4溶液的pH来控制水溶性维生素的电离，从而提高6种维生素在色谱柱上的保留能力，达到有效分离。试验结果见图1。

图1 流动相中缓冲液pH对6种水溶性维生素分离的影响Fig.1 Effect of the pH of the buffer in the mobile phase on separation of the six water-soluble vitamins

由图1可见，流动相中 KH2PO4的pH对VC、烟酸、VB1之间的分离影响很大，对其余3种维生素的分离影响不大，并且KH2PO4的pH对VB1的保留时间影响很大。当pH等于3.5时，VB1与VC峰部分重叠，VB1保留时间小于VC的保留时间，6种维生素的保留时间顺序为VB1

2.1.3 检测波长的确定

将6种维生素标准液分别扫描200 nm～350 nm的吸收光谱，试验结果表明：VC、VB1、VB6、VB2、烟酸、叶酸的最大吸收波长分别为 266、260、292、266、261、279nm，由于VB1、VB6的保留时间相差小，难以进行波长切换，又在VB6前后的几种水溶性维生素的最大吸收波长均在266 nm附近，故选择检测波长为266 nm。

2.2 方法学评价

2.2.1 线性范围及检出限

以标准维生素的一系列浓度，按上述色谱条件每种浓度进样5 μL。分别以各成分的峰面积y对标准工作溶液的质量浓度X（mg/L）进行线性回归分析，回归分析结果、检出限（信噪比S/N>3）列于表1，结果表明在表1所列的线性范围内，线性关系良好。

2.2.2 精密度与准确度

分别取5份云南普洱茶样品，按上述方法进行样品处理和色谱分离测定，由它们的结果计算方法精密度。本方法测定结果的相对标准偏差为2.9%～5.4%。采用加标回收率评价方法的准确度，结果表明，6种维生素的回收率测定范围在84.5%～102.7%。

表1 6种水溶性维生素的线性回归方程、相关系数、线性范围和检出限Table 1 Regression equation,correlation coefficients,linear ranges and detection limits of six water-soluble vitamins

2.3 样品测定

将样品按上述方法处理后，按最佳色谱条件对茶叶样品中的维生素含量进行了测定，测定结果见表2。普洱茶和信阳毛尖的色谱图见图2。

表2 普洱茶和毛尖茶中水溶性维生素含量Table 2 Content of water-soluble vitamins in Pu Er tea and Mao Jian tea mg/100 g

图2 茶叶样品色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of the tea samples

3 结论

采用酸水解法处理样品、流动相梯度洗脱，可简单、快速地测定茶叶中的5种水溶性VC、VB1、VB2、VB6和叶酸。结果表明：使用该方法检测，平均回收率为84.5%～102.7%，变异系数RSD<5.4%，准确度和精密度均能满足定量分析的要求，对食品、水果蔬菜中水溶性维生素的测定有一定的参考价值。

[1]Maria Cortes S M,Montana C H,Carmen D M.Comparison of highperformance liquid chromatography and spectrofluorimetry for vitamin C analysis of green beans[J].Eur Food Res Technol,2000,210:220-225

[2]邓光辉,李济权,马少妹.高效毛细血管电泳电导法快速检测复方维生素片中的、VB12、VB6和VC[J].分析实验室,2003,22(4):53-55

[3]成志强,孙成均,黎源倩.反相高效液相色谱法同时测定食品和多维片中8种水溶性维生素[J].分析化学,2001,29(9):1068-1071

[4]黄红霞.HPLC法测定蘑菇粉等中水溶性维生素的含量[J].海峡药学,1999,11(4):33-35

[5]贺利民,吕岱竹,苏贻娟.高效液相色谱法同时测定多种水溶性维生素[J].海南大学学报:自然科学版,2004,22(1):54-56

[6]申烨华,张萍,孔祥虹,等.高效液相色谱法同时测定扁桃仁中的水溶性维生素C,B1,B2,B6[J].色谱,2005,23(5):538-541

Determination of Five Water-Soluble Vitamins in Tea by High Performance Liquid Chromatography

GUO Yu-hua,YU You-zhu
(Department of Chemistry and Environmental Engineering,Anyang Institute of Technology,Anyang 455000,Henan,China)

A HPLC gradient elution method with UV detector was established to determine five Water-Soluble Vitamins in the tea.The optimized conditions as follows:XDB-C18column with methanol and 0.03 mol/L KH2PO4buffer (pH=6.1)as mobile phase,and gradient elution,detector wavelength was 266 nm.The correlation coefficients were more than 0.9990.The recoveries were 84.5%-102.7%,RSD<5.4%.For vitamins C,B1,B2,B6and Folic Acid,the contents were found to be 14.37 mg/100 g,2.17 mg/100 g,3.47 mg/100 g,1.58 mg/100 g and 1.34 mg/100 g in Puer tea;for Maojian tea,the contents of vitamins C,B2,B6and Folic Acid were 11.69 mg/100 g,8.12 mg/100 g,1.76m g/100 g,9.66 mg/100 g,respectively.While vitamin B1was not discovered in Maojian tea.

high performance liquid chromatography;water-soluble vitamins;tea

郭玉华（1979—），女（汉），讲师，硕士，主要从事药物分析化学研究。

2011-12-10