肉制品中瘦肉精药物残留检测方法的简化研究

高亦军，罗冠中

（天津市产品质量监督检测技术研究院，天津 300384）

肉制品中瘦肉精药物残留检测方法的简化研究

高亦军，罗冠中

（天津市产品质量监督检测技术研究院，天津 300384）

研究、探讨一种简化样品前处理过程的肉制品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇药物残留的检测方法。与国家标准GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》相比，该方法选取添加高浓度（70%～72%）高氯酸对酶解样品进行直接提取和沉淀蛋白，而后通过固相萃取净化，上机检验；省去了较为繁杂的调溶液pH，液液萃取等实验步骤，提高了整个过程的检验效率。通过对该方法检验结果的准确性、精密度、检出限的验证和评价，结果均符合国家标准对检验方法的要求。该方法可以尝试作为实验室肉制品中3种β2-受体激动药物残留的筛查，甚至检验的参考方法。

肉制品；克伦特罗；莱克多巴胺；沙丁胺醇；前处理；简化

克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇作为主要的β2-受体激动剂类药物能够调节动物机体物质代谢，促进蛋白质的合成和加速脂肪分解，实现营养再分配，俗称瘦肉精。瘦肉精虽然有助于动物生长和增加瘦肉率，但长期使用会使该药蓄积在动物组织中，会对动物和人的肝脏、肾脏等器官产生相当大的毒害作用，症状主要表现为头痛、头晕（54.2%）、四肢震颤（95.8%）、肌肉酸痛（75%）、多汗（47.9%）、胸闷（52.1%）和心悸（54.2%）等一系列症状[1]。我国已于1997年3月开始禁止生产和使用盐酸克伦特罗[2]，随后又明确禁止莱克多巴胺、沙丁胺醇等β2-兴奋剂用于养殖环节中，但是仍有不法分子违法兜售、使用盐酸克伦特罗、莱克多巴胺等“瘦肉精”药物，使药物残留蓄积在动物体内，传递到肉制品中，影响到食用者的健康和安全。

为此，我国农业、卫生、质检等多部门联合对动物食品中瘦肉精含量展开广泛、严厉的监管和检测，目前，肉制品中3种主要瘦肉精克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇的检测主要采用国家标准GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》，该方法准确，检出限能达到0.5 μg/kg，不过其样品前处理过程过于复杂，需要经过酶解、多步的提取、萃取、调节pH、氮吹等步骤[3]，使得检验效率降低，增加了大样品量肉制品的检验和风险监控的难度。本研究对肉制品中3种主要瘦肉精（克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇）药物残留检验的样品前处理步骤进行简化，提高检测效率，并且实验结果达到国家标准的要求水平。

1 材料与方法

1.1 材料

肉制品（酱猪头肉、火腿、熏鸡、酱牛肉）购于市场；标准样品（盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇及其同位素内标）购于德国Dr.Ehrenstorfer公司；β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶（10000 units/mL，德国MERCK）。

0.2 mol/L乙酸铵或乙酸钠缓冲液（配成浓度为0.2 mol/L乙酸铵或乙酸钠，用适量乙酸调节pH至5.2）；甲醇、高氯酸（70%～72%）、乙酸钠、氢氧化钠、异丙醇、乙酸乙酯、甲酸、5%氨水甲醇溶液、乙腈（色谱纯）、超纯水；固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL）。

1.2 主要设备及仪器

液相色谱-串联四极杆质谱联用仪（美国，Agilent，1200-6410B），全自动固相萃取仪（美国吉尔森GX-274 ASPEC）；恒温摇床，离心机，涡旋振荡器，氮吹仪，超纯水仪。

1.3 检测方法

1.3.1 样品提取

依照国标法检测的样品前处理过程完全按照GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》。

简化过程提取方法：称取2 g（精确到0.01 g）经匀浆的样品于50 mL离心管中，加入8 mL 0.2 mol/L乙酸铵缓冲液，加入100 μL浓度均为10 ng/mL的3种混合同位素内标标准溶液，再加入50 μL β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，混匀后，37℃恒温振荡12 h。取出后，涡旋1 min，于离心管中加入80 μL高氯酸后涡旋振荡，于4℃冷却（脂肪含量较低的样品可常温）离心10 min（10000 r/min），滤纸过滤，滤液待净化。

1.3.2 净化

将PCX固相萃取柱放入自动固相萃取仪，依次用3 mL甲醇，3 mL水活化，将样品滤液全部转移至固相萃取柱中，以0.5 mL/min流速过柱，用3 mL水，3 mL甲醇淋洗，抽干，最后用3 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液于40℃下氮气吹干，流动相1 mL溶解，待上机测试。

1.3.3 液相色谱—串联四极杆质谱仪检测

a）色谱柱：ZORBAX SB-C18，2.1（内径）×100 mm，粒度 1.8 μm。

b）流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。

梯度洗脱：0～1 min，4%B；1 min～1.01 min，4%～40%B；1.01 min～5 min，40%B；5 min～5.01 min，40%～90%B；停止时间9 min；平衡时间5 min。

c）流速：0.3 mL/min。

d）柱温：30℃。

e）进样量：10 μL。

f）离子源：电喷雾（ESI），正离子模式。

g）扫描方式：多反应监测（MRM）。

h）干燥气温度：350℃；干燥气流速：9 L/min；雾化气压：45 psi；毛细管电压：4000 V。

i）监测离子见表 1。

表1 多反应监测（MRM）下的选择离子及监测条件Table 1 Selected ion and monitoring conditions in multi-reactions monitoring

1.3.4 定性、定量方法

采用标准物质保留时间和化合物的一个母离子和一对子离子进行定性。

实验结果采用标准曲线法定量，用3种药物的同位素内标物法校正回收率。校正曲线方程见表2所示，其中 y为响应值（resp.），x为浓度（ng/mL），标准物质和内标物的线性范围均为0.5 ng/mL～20 ng/mL。

表2 3种药物的标准曲线及同位素内标标准曲线方程Table 2 Standard curve equation(ESTD&ISTD)for three drugs

2 结果与讨论

2.1 提取步骤简化条件的确定

肉制品中的主要成分是蛋白质和脂肪，在样品提取和纯化过程中，除去影响测定的主要干扰成分蛋白质和脂肪至关重要。GB/T 22286-2008标准方法是在酶解后，采用先添加0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，再用高氯酸（70%～72%）调节pH到1左右来沉淀蛋白，而后用氢氧化钠调pH至11，再用异丙醇-乙酸乙酯溶液提取，氮吹。此方法优点是在提取的同时也对样品进行了一定程度的净化，缺点是步骤繁多，降低检测效率，而过多的实验步骤容易造成结果重复性降低和偶然误差。本方法在对样品提取酶解后，试验通过直接添加高浓度高氯酸（70%～72%），一方面可以沉淀蛋白，另外可以水解一部分脂肪，同时可以使测定的目标化合物在酸性条件下离子化，增大溶出率和提取效率，并为下一步固相萃取净化提供样品液的酸性环境。对于脂肪含量较高的样品冷却离心可以将脂肪固化，过滤除去。相比于标准方法，本方法这一过程主要在提取残留药物的同时，除去主要干扰物蛋白质和脂肪，至于一些糖类和小分子化合物，将主要利用固相萃取法进行净化。

本实验对（70%～72%）高氯酸的添加量进行了优化，分别添加 20、40、60、80、100 μL，进行结果比较，结果对于大部分样品添加80、100 μL的样品除蛋白效果最好，而且对3种目标化合物检测回收率相当且最高，添加标准物浓度为10 μg/kg酱猪头肉检出3种药物绝对回收率（未经内标物校正）分别为克伦特罗83.5%，莱克多巴胺70.4%，沙丁胺醇75.2%，固选取添加80 μL高氯酸溶液。

2.2 简化前处理方法对检测结果准确性、精密度的影响

在没有获得阳性样品时，检验结果的准确性通常用加标回收率来评价[4]。本实验选取4种未检出目标待测药物的空白样本酱猪头肉、火腿、熏鸡、酱牛肉作为样品基质，添加低、中、高3个标准水平浓度，每个浓度样品用简化法处理，经6次测定取平均值，定性、定量方法按照1.3.4，测得结果计算回收率（表中回收率是经同位素内标校正的检测结果回收率）和相对标准偏差，分析结果如表3所示。

3种药物的加标回收率分别为克伦特罗90%～113%，莱克多巴胺86%～102%，沙丁胺醇93%～110%，均达到国家标准GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》检验方法确认中关于回收率的要求[5]，而且经内标物校正的回收率波动范围与检测结果的偏差相当，这个波动基本上可认为是检测结果的偏差所致，可见经同位素内标法定量校正的结果准确度更高，基本消除了质谱检测常见的基质效应的影响[6]。3种药物不同水平检测结果的相对标准偏差分别为克伦特罗5.4%～13.8%，莱克多巴胺5.0%～14.5%，沙丁胺醇3.7%～14.0%。远远低于GB/T 22286-2008提出的精密度要求：在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的30%，同时也达到GB/T 27404-2008提出的对检验方法精密度的要求[5]。

表3 3种β2-受体激动剂类药物的4种样品基质的加标回收率和相对标准偏差（RSD）Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)for the 3 β2-agonists drug residues of 4 spiking sample matrixes %

2.3 方法检出限

国家标准GB/T 22286-2008中3种药物残留检测方法的检出限为0.5 μg/kg。研究简化前处理方法对检出限的影响，选取四种肉制品（酱猪头肉、火腿、熏鸡、酱牛肉）作为样品基质，通过在四种空白样品中加入3种药物的标准物、同位素内标物，使其在样品中浓度均为0.5 μg/kg，进行检测结果评价，结果均能达到3倍信噪比的检出限要求，图1为加标后的检测谱图（该样品基质为酱猪头肉）。

图1 加标量为0.5 μg/kg样品检测结果的总离子流图（样品基质为酱猪头肉）Fig.1 Total ion current chromatography of sample matrix(salted head meat)with 0.5 μg/kg spiked

3 结论

肉制品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇在依据国家标准GB/T 22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定液相色谱串联质谱法》检验的基础上，通过简化和调整样品前处理方法，省去了较为繁杂的实验步骤，提高了整个过程的检验效率。同时，在检验结果的准确性、精密度、检出限方面均能符合检验标准的要求，该方法可以尝试作为实验室大量肉制品中3种瘦肉精的筛查，甚至检验的参考方法。

[1]徐聪.瘦肉精的危害与畜产食品安全[J].黑龙江畜牧兽医综合指导版,2011,7(下):49-51

[2]赵思俊,郑增忍.“瘦肉精”的危害及监管检测技术[J].中国动物检疫,2011,28(4):1-4

[3]郭德华.GB/T22286-2008动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定-液相色谱串联质谱法[S].北京:中国标准出版社出版,2008:1-2

[4]Noel S Lawson,Thomas L Williams,Thomas Long.Matrix effects and accuracyassessment[J].Arch Pathol Lab Med,1993,117(10):401-411

[5]鲍晓霞.GB/T27404-2008实验室质量控制规范 食品理化检测[S].北京:中国标准出版社出版,2008:26

[6]王国民,彭涛.两种SPE净化测定克伦特罗等β2-受体激动剂的基质效应[J].检验检疫学刊,2011,3(21):16-19

Research on Simplified Detection Method of Clenbuterol Residues in Meat Product

GAO Yi-jun,LUO Guan-zhong
（Tianjin Product Quality Inspection Technology Research Institute,Tianjin 300384,China）

A simplified sample preparation process is studied and discussed for the detection method of clenbuterol,ractopamine,salbutamol residues in meat product.Compared with the national standard GB/T 22286-2008,the method simplified more complex experimental steps and improved the efficiency of the whole inspection process.To achieve this purpose,the perchloric acid in high concentration（70%-72%）was added to the zymolytic sample to extract the target compounds and deposit protein,and then a further purification was carried out by solid phase extraction.The final result was tested on liquid chromatography with tandem quadrupole mass spectrometry.The accuracy,precision and detection limit of this simplified method was tested and verified accordingly with the national standard demand.And the method can be used as a screening and even determination method for the testing the laboratory to test the 3β2-agonists drug residues in meat product.

meat product;clenbuterol;ractopamine;salbutamol;sample preparation;simplify

高亦军（1967—），女（汉），高级工程师，本科，从事食品安全分析、实验室质量管理研究。

2012-05-25