新疆南疆地区奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌生物膜形成及其相关基因的检测

李延荣 陈 伟，2

(1 新疆兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

(2 新疆兵团塔里木畜牧科技重点实验室/塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300)

奶牛乳腺炎是危害奶牛业发展的重要疾病之一，流行病学调查表明使用抗生素治疗其治愈率在0～80%之间不等，其中最难治疗的是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的感染。而近年来的研究表明［1］，金黄色葡萄球菌形成的生物膜具有高度的耐药性并能逃避免疫系统的攻击，其感染易慢性化并难于控制。因此研究奶牛乳腺炎的病原菌之一——金黄色葡萄球菌生物膜形成状况及机制尤为重要。本研究检测了分离自本地区奶牛场的金黄色葡萄球菌其生物膜形成状况以及可能在生物膜形成的不同阶段发挥作用的相关基因的分布情况，为该地区金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳腺炎防制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

PCR仪(Bio－Rad)、移液枪(Eppendorf)、恒温培养箱(上海)、水浴锅(金怡)、96孔板(Labphil Biotechnology)、电热恒温干燥箱(DHG－9031A)等。

1.2 实验药品

胰蛋白胨大豆肉汤(TSB培养基，BactoTM)、PCR相关试剂均购自东盛生物公司，实验所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 实验菌株

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC35984(BF+)由上海复旦大学医学院赠送，其它实验菌株均为本实验室分离鉴定所得。

1.4 金黄色葡萄球菌生物膜形成能力的检测

根据任晓镤等［2］的方法，即将富集培养过夜的菌液按1:100比例吸取20 μL菌液接种至2 mL TSB液体培养基中，振荡混匀后，吸取200 μL至96孔细胞培养板中，每个实验菌株接种4孔，同时设立阳性对照(ATCC 35984)及空白对照(不加菌液的TSB培养基)各4孔。37℃恒温静置培养24 h后，将培养液轻轻拍出，无菌水洗去未粘附的悬浮菌体及培养液，该步骤重复4次。56℃烘干固定1 h。用50 μL 0.5%结晶紫染液浸染5 min，流水冲洗多余染液，直至冲洗流出的水为无色，37℃晾干。用酶标仪测定490 nm处的OD值。所有生物膜形成检测实验均在不同时间重复3次。

1.5 金黄色葡萄球菌生物膜形成相关基因检测

1.5.1 ica 基因的检测

［3］中icaA基因的引物序列合成引物，见表1

表1 ica依赖型生物膜形成相关基因

PCR反应条件:

预变性95℃，5 min;变性 95℃，60 s;退火50℃，30 s;延伸72℃，30 s;36个循环;末次循环后72℃，10 min;电泳检测。

1.5.2 非ica基因的检测

参考相关文献［4，5］选择7个与金黄色葡萄球菌生物膜形成有关的基因，并设计引物，见表2

PCR反应条件:

预变性95℃，5 min;变性 95℃，60 s;退火45℃，30 s;延伸72℃，30 s;36个循环;末次循环后72℃，10 min;电泳检测。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌生物膜形成的表型检测

本实验采用微量板半定量法对患有隐性乳房炎的奶牛乳样中分离得到的金黄色葡萄球菌进行生物膜形成的表型检测，检测结果表明，112株金黄色葡萄球菌中，有31株菌可形成不同强度的生物膜，约占检测菌株总数的27%。说明在当地奶牛场能形成生物膜的乳房炎金黄色葡萄球菌已经占有了一定的比例，这种生物膜形成菌株的出现，为临床治疗奶牛乳房炎提出了新的要求。

2.2 ica基因座在实验菌株中的分布情况

本实验对112株金黄色葡萄球菌临床分离株进行icaA基因的PCR检测，其中含有icaA基因的菌株15株，占检测菌株总数的13.4%(15/112)。

2.3 ica非依赖性生物膜形成相关基因的检测结果

本实验对分离获得的112株金黄色葡萄球菌，分别进行 sarA、ccp、luxS、sigB、agrC、bap、tcaR 7 个基因的PCR检测，检测结果表明，112株金黄色葡萄球菌分离株上述7种基因的分布存在较大差异，其生物膜形成能力也存在差别，具体结果见表3。其中34株扩增出luxS基因的菌株和36株扩增出sarA基因的菌株，各有6株能形成不同强度的生物膜，分别占基因扩增阳性菌株数的18%和17%，而其中生物膜形成能力较强的菌株5－100－1和5－128－2都含有ica及ccp基因，说明菌株生物膜形成能力可能与ica及ccp基因的产物有关。

表3 非ica依赖型各个基因的检测结果

3 讨论

3.1 ica基因在细菌生物膜形成中的作用

细菌生物膜(biofilm formation，BF)的形成主要经过四个阶段:细菌的初始黏附，细菌的聚集，细菌生物膜的成熟和生物膜细菌的释放。而根据其在初始粘附阶段依赖的胞外多聚物是以多糖为主还是以其它物质，如蛋白质为主，可将细菌生物膜形成机制分为 ica依赖型和 ica非依赖型两种［4，6］。ica基因座以操纵子的形式存在于细菌染色体上，主要包括icaA、icaD、icaB和icaC以及位于icaA上游的阻遏基因icaR［5］，icaADBC介导产生的胞外多糖是ica依赖性生物膜形成初始粘附阶段的主要功能性物质，而其中含有的II型多糖PIA(polysac charide－intercellular adhesin)是生物膜的主要组成成份，也是细胞成簇的主要功能性物质［7］。本研究检测的菌株中，含有icaA基因的有15株，生物膜检测实验结果表明，生物膜阳性菌株中含有icaA基因的菌株仅有2株，即不是所有含ica基因的金葡菌都能形成生物膜，且有部分生物膜阳性菌株并不含有ica基因。

对于ica基因座在菌株中的分布与生物膜阳性菌株的相关性，刘庆中等研究表明，检测含有ica基因座的菌株与生物膜表型检测的阳性菌株结果并不一致，即检测含有ica基因座的菌株其生物膜表型检测呈阴性［8］。本实验的研究结果也证实了这一观点。产生这一现象的原因可能是ica基因的表达受环境因素以及生物膜非ica依赖性机制导致的结果。同时，本实验结果也表明该地区奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌生物膜形成存在ica依赖性及ica非依赖性两种形成机制［4］，而任晓镤等研究者检测同一地区的表皮葡萄球菌中未检测到ica基因［6］，说明本地区表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌生物膜的形成机制存在差异。

3.2 群感效应(quorum sensing，QS)相关基因在细菌生物膜形成中的作用

群感效应是指细菌能够分泌特定的信号分子并感应它的浓度，当信号分子浓度达到阈值时，可以调控生物膜形成和其它生物学功能，如毒力因子的分泌等。在葡萄球菌中与群感效应有关的基因有agr、luxS、sarA、sigB 等基因。

群感效应附属基因调节子(accessory gene regulator，agr)系统是葡萄球菌生物膜形成的重要调节系统，即agr系统。agr系统组成成分之一AgrC具有组氨酸蛋白激酶活性，它与另一个组分AgrA共同构成了金黄色葡萄球菌双组成信号传递系统。agr系统激活后，能够通过不同途径调节一系列相关基因的表达［9，10］。本实验对 agrC 基因进行检测，检测结果表明有3株菌含有agrC基因，而这3株菌恰恰为生物膜形成阴性菌株。有学者已经在表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中发现agr系统可降低细菌对聚合物固相表面的粘附能力，负调控生物膜的形成［11，12］。本研究的结果可能支持了这一结论。

在表皮葡萄球菌中luxS主要通过调节ica基因座的转录及PIA的产生，达到抑制生物膜形成的作用。但在金黄色葡萄球菌中，该基因是否对金黄色葡萄球菌的生物膜形成有关尚不明确［9］。本实验室分离得到的金黄色葡萄球菌中该基因存在于其中的34株菌中，而只有6株生物膜阳性菌株中含有该基因。Kuehl等研究表明抑制金黄色葡萄球菌luxS的表达，可促进生物膜的形成，说明luxS对生物膜形成能力起负调控作用。而本研究的实验结果表明82%含有该基因的菌株不能形成生物膜，也验证了这一结论。

sarA基因是葡萄球菌附属调节因子A(staphylococcal accessory regulator A，sarA)，是另一个群感效应系统的成员，编码SarA蛋白。有研究发现表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌中sarA基因对PIA的合成是必须的。在金黄色葡萄球菌中，sarA还可以正调控生物膜形成相关蛋白Bap的表达，表明该基因参与葡萄球菌生物膜形成的ica依赖性与ica非依赖性两条途径［4］。本实验在112株检测菌株中，含有sarA基因的菌株36株，而在生物膜阳性菌株中检测到含有该基因的菌株有6株，同时还含有ica基因的有2株。这一结果说明本地区分离获得的奶牛乳房炎性金黄色葡萄球菌其sarA基因可能参与了生物膜形成的ica依赖性与ica非依赖性两条途径。

sigB基因是调控葡萄球菌生物膜形成及毒素因子表达的全局调节子，因此其功能比较复杂。在金黄色葡萄球菌中该基因可对agr及sar基因进行调控，从而影响生物膜的形成。本实验分离得到的临床分离株中，含有该基因的菌株38株，生物膜阳性菌株为4株，其中2株菌同时含有sarA基因及sigB基因。但sigB基因在这些菌中的作用需进一步验证。

3.3 其它基因在葡萄球菌生物膜形成中的作用

bap基因，即生物膜相关蛋白基因(biofilm－associated protein，bap)编码金黄色葡萄球菌表面蛋白Bap。Bap蛋白在BF形成的不同阶段，其表达量呈周期性变化，以促进黏附或促进释放。本实验室分离得到的金黄色葡萄球菌含有bap基因的菌株17株，而其中仅有1株为生物膜阳性菌株，同时该菌株含有sarA基因，说明bap基因表达可能受sarA基因的正调控［4，9］。

ccp基因主要是在葡萄球菌生物膜形成的聚集及细胞成丛阶段发挥作用，敲除该基因则不能形成成熟的生物膜，但不影响生物膜形成过程中的初始粘附阶段。本实验分离得到含ccp基因金黄色葡萄球菌51株，31株生物膜阳性菌株中有7株菌含有该基因。生物膜形成能力较强的2株菌同时含有ica及ccp基因，而另有2株生物膜形成弱阳性菌株只含有ccp基因而不含ica基因。说明ccp基因与ica基因的表达产物可能相互协同，共同促进生物膜的形成。

tcaR基因在一般情况下，会与特定的DNA序列相互作用以抑制生物膜形成，当抗生素，如替考拉宁存在时，能与tcaR结合使tcaR的结构发生变化，从而失去活性，使生物膜形成及抗药性基因正常启动。本实验室分离得到的12株金黄色葡萄球菌含有该基因，其中11株为生物膜形成阴性菌株，可能与tcaR基因对生物膜的负调控有关。

本实验对当地奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌生物膜形成表型和相关基因进行了检测。从本实验的结果可知，当地分离获得的金黄色葡萄球菌其生物膜形成同时存在ica依赖性与ica非依赖性两条途径，且所选择的8个与生物膜形成有关的基因在本地区奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌生物膜形成菌株中均有不同比例的分布。该研究结果说明本地区奶牛乳腺炎性金黄色葡萄球菌生物膜形成机制复杂，为防制葡萄球菌生物膜引起的相关感染奠定理论基础。

参考文献

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