南瓜叶中γ-氨基丁酸的提取及薄层扫描测定

黄美娥，彭 胜，陈阳波，袁洪昆

1吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室;2吉首大学城乡资源与规划学院，张家界427000

南瓜(Cucurbita moschata Duch.)系葫芦科南瓜属一年生蔓生草本植物，种植历史悠久，世界各地均有栽培［1］。南瓜性味甘温，入脾胃二经，具有补中益气、消炎止痛、解毒杀虫等功效。对其功能成分如γ-氨基丁酸、葫芦巴碱等的研究报道很多［2］。南瓜叶作为保健食品资源之一，资源丰富，天然无公害，但国内外关于从南瓜叶中提取γ-氨基丁酸的研究鲜有报道。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)，是一种重要的功能性非蛋白质氨基酸，参与体内的多种代谢活动，具有很高的生理活性。GABA在医药、食品、饲料中具有广阔的应用前景，2009年9月 29日，GABA已被中华人民共和国卫生部批准为可用于食品生产加工的新资源，开发GABA产品及其功能性食品、保健品是当前食品及医药领域的研究热点之一［3］。因此利用南瓜叶提取GABA，对充分利用南瓜资源具有重要的经济意义和现实意义。本实验通过对南瓜叶中GABA的提取测定进行研究，旨在为南瓜叶的进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法［4-7］

1.1 材料、试剂与仪器

南瓜叶:于7月采集吉首大学张家界校区后山菜园鲜南瓜叶，置恒温干燥箱中50℃干燥至恒重，粉碎过40目筛，保存，备用。

γ-氨基丁酸标准品:中国药品生物制品检定研究所，纯度≥99%;薄层层析硅胶G、茚三酮、正丁醇、冰醋酸、无水乙醇等均为分析纯。

日本岛津CS-9000型薄层扫描仪、RE-540旋转蒸发仪、WT-150粉碎机、CS101-3D电热鼓风干燥箱、DSY-2-4孔电热恒温水浴锅(北京国华医疗器械厂)、AEG-200十万分之一天平。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的配制

精密称取γ-氨基丁酸对照品25 mg置于25 mL容量瓶中，用20%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成1 mg/mL的对照品溶液，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备

称取南瓜叶样品粉末10.00 g，加入20%的乙醇溶液100 mL，浸提1 h，过滤，定容至100 mL，摇匀，制得南瓜叶供试品溶液，备用。

1.2.3 薄层色谱条件与薄层扫描条件［3］

称取硅胶G 30 g放入研钵中，加入0.5%CMCNa和60 mL水调成糊状后涂布于玻璃板(10 cm× 20 cm)上，厚度为0.5 mm，置室温风干后于105℃活化1 h，置干燥器中备用。分别吸取5 uL的对照品溶液和供试品溶液点样，用正丁醇、醋酸、水按4∶1∶1的比例配成展开剂，饱和后按上行方式展开。用0.2%茚三酮乙醇溶液喷雾显色，105℃烘数分钟，直至获最大斑点，薄层扫描，根据薄层扫描结果确定南瓜叶中γ-氨基丁酸的薄层扫描条件为:反射式双波长线式扫描，λs=515 nm，λr=680 nm，狭缝为1.0*10.0 mm，SX=1。

1.2.4 标准曲线的制备

称取γ-氨基丁酸对照品100 mg用蒸馏水定容至100 mL，得1 mg/mL的γ-氨基丁酸对照品溶液。分别吸取1 mg/mL的γ-氨基丁酸对照品溶液，配成0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL的系列对照溶液。于硅胶板上点样，层析展开、显色、薄层扫描，以对照溶液浓度为横坐标(x)，峰面积积为纵坐标(y)，建立标准曲线，得回归方程为y=77747x+ 4948.7，相关系数R2=0.9991。表明γ-氨基丁酸薄层扫描时浓度在0.125～2.0 mg/mL范围内有较好的线性关系。

1.2.5 稳定性试验

用毛细点样管吸取对照品溶液5 μL点于薄层板上，按上述条件展开、显色、薄层扫描，每隔30 min扫描1次，共测定5次，计算峰面积的RSD(n=5)为5.34%，RSD(n=4)为2.50%，表明显色后在2 h内较稳定。

1.2.6 重复性试验

用毛细点样管吸取同一南瓜叶供试品溶液5 μL点样，按上述条件展开、显色、薄层扫描，重复扫描6次，结果RSD为0.98%。

1.2.7 精密度实验

同板精密度试验:用毛细点样管吸取对照品溶液5 μL点样(重复点6个点)，按上述条件展开、显色、薄层扫描，结果RSD为1.99%。异板精密度试验:用毛细点样管吸取对照品溶液5 μL点于6块薄层板上，按上述条件展开、显色、依次扫描测定，结果RSD为2.13%。

1.2.8 加样回收试验

将对照品溶液5 μL，供试品溶液6 μL和对照品溶液5 μL，与供试品溶液3 μL的混合液分别点于同一薄层板上，按上述条件展开、显色、扫描，测得平均回收率(n=4)为99.61%，RSD(n=4)为2.04%。

1.2.9 提取条件的确定

1.2.9.1 提取溶剂的选择

称取10.00 g南瓜叶粉末10份于三角瓶中，分别加入蒸馏水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇各100 mL，于常温浸提1 h，过滤，滤渣重提1次，合并滤液;分别进行减压浓缩、醇沉、过滤、浓缩，扫描测定。

1.2.9.2 提取时间的选择

称取10.00 g南瓜叶粉末10份于三角瓶中，加入20%乙醇100 mL，于常温下分别浸提1、2、3、4、5 h，过滤，滤渣重提1次，合并滤液;减压浓缩、醇沉、过滤、浓缩，扫描测定。

1.2.9.3 提取料液比的选择

称取10.00 g南瓜叶样品10份于三角瓶中，分别加入20%乙醇80、100、120、140、160 mL，于常温下浸提1 h，过滤，滤渣重提1次，合并滤液;减压浓缩、醇沉、过滤、浓缩，扫描测定。

1.2.10 正交试验

由单因素试验确定的范围，选择乙醇浓度、固液比、提取时间三因素作为考察对象，每因素确定三个水平，进行正交试验，因表水平见表1。

表1 正交试验因素表Table 1 Orthogonal experiment facts

2 结果与分析

2.1 提取条件的单因素实验确定

2.1.1 提取溶剂的选择结果

按1.2.9.1进行提取测定，提取溶剂对南瓜叶中γ-氨基丁酸提取效果的影响结果为:以水和高浓度乙醇为提取溶剂比稀乙醇的提取效果差，以20%乙醇为提取溶剂进行提取实验得γ-氨基丁酸含量值最高为156 mg/100 g，故选择提取溶剂浓度的优化区为10%～30%。

2.1.2 提取时间的确定

按1.2.9.2进行提取测定，提取时间对南瓜叶中γ-氨基丁酸提取效果的影响结果为:随着提取时间的延长，提取得到的γ-氨基丁酸的含量反而逐渐降低，提取时间为1 h进行提取实验得γ-氨基丁酸含量值最高为148 mg/100 g，故选择提取时间的优化区为0.5 h～1.5 h。

2.1.3 固液比的选择

按1.2.9.3进行提取测定，提取料液比对南瓜叶中γ-氨基丁酸提取效果的影响结果为:随料液比的增大，南瓜叶中γ-氨基丁酸的含量不断提高，但料液比为1∶14～16时，增大料液比，含量增加放缓。所以，选择料液比的优化区为1∶15～17。

2.2 正交实验结果与分析

表2 正交试验结果表(n=3)Table 2 The effects of orthogonal experiment(n=3)

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis

对表2中数据进行方差分析，结果由表3可见，因素B显著，因素A和C不显著，因素作用的主次顺序是B＞A＞C，即浸提时间＞溶剂浓度＞料液比，与极差分析得出的结果一致。对表2数据进行分析得出南瓜叶中γ-氨基丁酸提取条件最优水平组合为A2B2C3，即以20%乙醇为溶剂、浸提1 h、料液比1∶17，其γ-氨基丁酸的含量为209 mg/100 g。

2.3 验证实验

按上述最佳条件A2B2C3进行3次验证提取试验，测得南瓜叶中γ-氨基丁酸的含量分别为210、205、212 mg/100 g，平均含量209 mg/100 g。

3 结论

本研究采用单因素和正交试验确定了南瓜叶中γ-氨基丁酸的提取条件，即精密称取供试品适量，加入17倍体积的20%乙醇、常温浸提1 h。并以薄层扫描法测定南瓜叶中γ-氨基丁酸的含量为209 mg/ 100 g，其方法操作简单、灵敏，结果准确可靠。

1 Jiangsu New Medical College(江苏新医学院编).Dictionary of Chinese Materia Mediaca(中药大词典(上册)).Shanghai:Shanghai Scientific＆Technical Publishers，1985.1555-1560，3225.

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3 Wei ZZ(魏珍珍)，Zhao M(赵明)，Li SR(李双容)，et al.Study on feasibility of determination of GABA content in tea by colorimetric method.Acta Agric Jiangxi(江西农业学报)，2010，22(8):56-58.

4 Huang ME(黄美娥)，Yu HZ(于华忠)，Cao Y(曹庸).Extraction and determination of γ-aminobutyric acid in fern.A-mino Acids＆Biotic Resour(氨基酸与生物资源)，2004，27:77-78.

5 Deng K(邓康)，Luo J(罗健).TLC scanning determination of 4 kinds of neurotransmitter in mouse brain.Northwest Pharm J(西北药学杂志)，2000，15:150-151.

6 Zhao CQ(赵长琦)，Li GM(李广民)，Wang J(王军).TLC-densitometric determination of hypotensive constituent γ-aminobutyric acid in Hongqi.J Northwest Univ，Nat Sci(西北大学学报，自科版)，1995，6:277-278.

7 Pang MJ(逄敏洁)，Li DW(李多伟)，Wang YC(王义潮)，et al.TLC scanning determination of sclareol.Chin J Pharm Anal(药物分析杂志)，2008，28:1554-1555.