草苁蓉水萃取物对脂多糖与D-氨基半乳糖所致小鼠肝脏氧化应激和细胞凋亡的影响

尹学哲， 许惠仙， 赵文玺， 全吉淑

（1.延边大学 附属医院，吉林 延吉 133000；2.延边大学 医学院，吉林 延吉 133002）

草苁蓉 （Boschniakia rossica Fedtsch.et Flerov）又名不老草，为列当科草苁蓉属多年生寄生性草本植物，国家二类保护植物。草苁蓉性味甘、酸、涩，全草入药。具有补肾壮阳、润肠止血、滋补强身、延年益寿的功效；用于治疗肾虚阳痿、腰膝冷痛、老年性习惯便秘、膀胱炎、功能性子宫出血、肾炎、前列腺炎，以及肾脏和膀胱出血等疾病[1]。研究发现，草苁蓉具有抗脂质过氧化、抗炎、增强免疫及抗肿瘤等作用[1-3]，这与草苁蓉醛、草苁蓉内酯、草苁蓉酸、草苁蓉碱、草苁蓉纳拉苷和糖类等多种活性成分有关[4]。草苁蓉多糖是从草苁蓉中提取出来的生物活性成分，是草苁蓉水萃取物（BRAF）的主要成分[5]。它无毒，具有抗肿瘤和免疫增强功能[4-5]。本实验通过建立脂多糖（LPS）及D-氨基半乳糖（GalN）联合诱导的小鼠急性肝损伤模型，观察BRAF对小鼠急性肝损伤的保护作用，为草苁蓉的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 昆明小鼠，雄性，体质量为18～22 g，由延边大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂和仪器 LPS及GalN，Sigma公司产品；水飞蓟素（SIL），沈阳东陵药业股份有限公司产品；TNF-α ELISA试剂盒，武汉博士德公司产品；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、一氧化氮（NO）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）及蛋白质试剂盒，南京建成科技有限公司产品。3-30K型离心机，Sigma公司提供；S22PC型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；RT-2100型酶标仪，深圳雷杜公司产品；BA200型生物显微镜，中国麦克奥迪实业集团有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 BRAF的制备 草苁蓉采自吉林省长白山，经延边大学药学院刘勇镇教授鉴定为草苁蓉Boschniakia rossica Fedtsch.et Flerov。草苁蓉用体积分数90%乙醇提取后，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，水层经减压蒸馏，即得BRAF，得率约为3.2%[2]。主要成分有多糖（质量分数67.0%）和蛋白质（质量分数3.1%）。

1.2.2 实验动物分组及处理 将小鼠按体质量随机分为5组，即正常组、模型组，BRAF高、低剂量组和SIL组。每日灌胃给药1次，连续7 d，BRAF高、低剂量分别为240、120 mg/kg，SIL剂量50 mg/kg，正常组及模型组小鼠则以等体积蒸馏水灌胃。末次给药1 h后，除正常组外，其余各组小鼠腹腔注射给予500 mg/kg GalN和10 μg/kg LPS（用无菌生理盐水配制）。造模期间禁食，不禁水。

1.2.3 血清转氨酶及TNF-α水平的检测 造模1.5 h后，分离血清，ELISA法检测小鼠血清TNF-α含量。再次造模8 h后，分离血清，检测小鼠血清ALT、AST活性。

1.2.4 肝组织病理学检查 造模8 h后处死动物，取小鼠肝左叶，固定于质量分数10%福尔马林溶液中，常规石蜡包埋、切片、HE染色，在光镜下观察肝组织病理学变化。

1.2.5 肝组织氧化应激与抗氧化相关指标、DNA损伤及细胞凋亡相关指标的检测 4℃裂解肝细胞，离心取上清液。按测试盒操作方法测定CAT、GPx、GST、GSH、MDA、NO 水平。 提取肝细胞 DNA，上琼脂糖凝胶电泳，检测肝细胞DNA损伤情况。

1.2.6 统计学处理 数据以x¯±s表示，组间均数比较采用SPSS11.5统计软件，以单因素方差分析和Turkey's多因素t检验进行。

2 结果与分析

2.1 BRAF 对急性肝损伤小鼠肝组织病理学的影响

如图1所示，模型组小鼠肝小叶结构模糊，可见大量肝细胞坏死，肝细胞核明显大小不等，呈不同程度的固缩，凋亡严重，可见大量凋亡小体。BRAF和SIL干预均能减轻上述肝组织病理学损伤，凋亡肝细胞明显减少。

图1 肝组织病理学观察结果 （HE×200）Fig.1 Pathological observation of liver sections（HE×200）

2.2 BRAF对急性肝损伤小鼠血清 ALT、AST、TNF-α以及肝组织NO水平的影响

如表1所示，腹腔注射GalN/LPS后1.5 h，模型组小鼠血清TNF-α水平升高，注射8 h时模型组小鼠血清ALT和AST活性明显上升，肝组织NO水平也明显升高（P＜0.05）；而BRAF高、低剂量组和SIL组小鼠血清ALT、AST、TNF-α和肝NO水平与模型组比较明显降低（P＜0.05）。

表1 BRAF对急性肝损伤小鼠血清ALT、AST、TNF-α和肝组织NO水平的影响（x¯±s，n=10）Table 1 Effect of BRAF on serum TNF-α and hepatic NO levels of mice with acute liver injury（x¯±s，n=10）

2.3 BRAF对急性肝损伤小鼠肝组织抗氧化活力和脂质过氧化水平的影响

如表2所示，腹腔注射LPS和GalN明显降低模型组小鼠肝组织 CAT、GPx和 GST活性 （P＜0.05），降低肝脏 GSH 水平（P＜0.05），增高肝脏 MDA含量 （P<0.05）。而BRAF治疗可回升小鼠肝CAT、GPx、GST 活性和 GSH 含量（P<0.05），降低肝 MDA水平。说明BRAF可升高GalN/LPS所致急性肝损伤小鼠肝脏抗氧化防御能力，降低肝脏氧化应激。

2.4 BRAF对急性肝损伤小鼠肝组织DNA损伤的影响

DNA电泳结果显示，注射LPS和GalN可明显增高模型组小鼠肝细胞DNA损伤，损伤肝细胞DNA断裂形成梯形条带，呈现细胞凋亡的结构特征。另有部分DNA随机降解成模糊涂片状，呈现细胞坏死特征。电泳图条带的灰度值比较结果显示，模型组小鼠肝细胞DNA断裂和降解均明显高于正常组（P＜0.05），而BRAF和SIL预处理可明显降低急性肝损伤小鼠肝细胞DNA断裂和降解程度（P＜0.05）。

表 2 BRAF 对急性肝损伤小鼠肝组织 CAT、GPx、GST、GSH 和 MDA 水平的影响（x¯±s，n=10）Table 2 Effect of BRAF on hepatic CAT，GPx，GST，GSH and MDA levels of mice with acute liver injury（x¯±s，n=10）

图2 BRAF对急性肝损伤小鼠肝组织DNA损伤的影响Fig.2 Effect of BRAF on DNA damage of liver in mice with acute liver injury

3 讨论

肝损伤是指在一系列理化因素的作用下，肝细胞发生不同程度的肿胀、变性、坏死和凋亡的病理状态。在肝细胞病变过程中，自由基、酶及脂质过氧化等均发挥主要作用[6]。GalN/LPS诱导的肝损伤小鼠是研究急性肝损伤十分理想的动物模型。GalN诱发的动物肝组织损伤在形态学和功能学上与人类急性重症肝炎相似，而小剂量LPS可诱导GalN致敏小鼠发生以细胞凋亡为重要特征的急性肝功能衰竭[7]。细胞凋亡过程中氧化应激起着关键性作用，氧化应激状态下，机体活性氧自由基产生过多，同时抗氧化体系功能下降，进而对机体产生损伤[8]。为了对抗氧化应激引起的各种损伤，有氧生物在进化过程中发展了多种抗氧化防御机制，包括各种抗氧化酶和解毒酶，如 SOD、CAT、GPx和 GST等，可与GSH等抗氧化剂一起有效清除体内脂质过氧化物，使机体免受自由基的损害[9]。本实验表明，模型组小鼠血清转氨酶、肝组织抗氧化酶活性及GSH水平降低，肝脏脂质过氧化水平升高。BRAF预处理可逆转这些血清及肝脏指标，提示BRAF可提高GalN/LPS所致急性肝损伤小鼠肝脏抗氧化防御能力和抑制脂质过氧化反应，抑制急性肝衰竭氧化应激，这可能是BRAF保护肝损伤的重要机制之一。

血清TNF-α在炎性反应的发生、发展过程中发挥关键作用[8]。LPS使GalN致敏小鼠发生得肝细胞凋亡是由释放入血循环的TNF-α所致，进而引起白细胞介素等炎症因子的释放[8]。在炎症反应中，NO大量释放也被人们关注和广泛研究。NO是一种细胞信使分子和细胞毒性分子，是组织损伤的诱发因子和各种病变的增强因子，能引起肝损伤。NO的这种双重性在肝脏疾病的发生与治疗中具有重要作用[10]。而TNF-α被认为是NO合成的一个重要调节者[8]。本实验中发现肝衰竭时，GalN/LPS腹腔注射1.5 h，血清TNF-α水平升高，注射8 h时肝脏NO水平也增高，而BRAF预处理可降低血清TNF-α和肝脏NO水平，从而减少炎症反应的发生。

细胞凋亡是LPS诱导GalN致敏小鼠最重要的肝细胞死亡形式[7-9]。其明显的生化特征是形成180-200 bp或者其多聚体组成的寡核苷酸片段[11]。本实验结果显示，腹腔注射LPS和GalN能使肝细胞DNA发生断裂形成有规则片段，而BRAF明显降低肝细胞DNA断裂程度，提示BRAF可抑制急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡。同时，BRAF还明显降低LPS/GalN所致肝损伤小鼠的肝细胞DNA随机降解，减少肝细胞DNA损伤。

综上所述，BRAF对LPS/GalN所致小鼠急性肝损伤具有保护作用，其机制可能与其提高抗氧化活性、减少炎症反应和抑制肝细胞凋亡作用有关。

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