20种川产道地药材对番茄灰霉菌的抑制作用研究

刘铁秋，孙雪丹，何 苗，罗 友，卢 勇，曾宪垠，*

（1.四川农业大学原子能农业应用研究室，四川雅安625014；2.四川农业大学生命科学与理学院，四川雅安625014；3.四川玛思特农业开发有限公司，四川南充637105）

番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）侵染所致，该病危害番茄的整个生育期和全株，是一种世界性病害[1]。随着番茄保护地种植面积的不断扩大，该病并没有得到全面有效的防治，其仍是番茄温室病害及储存番茄腐烂的重要因素[2-3]。由于尚未发现该病抗源，抗病育种难以进行，致使该病的控制、防治困难，其防治手段仍主要依靠化学杀菌剂[4]。灰葡萄孢繁殖迅速，可多次浸染并形成较高病原基数；其遗传变异率高，极易产生抗药性，虽然在化学防治上研究的很深入[5-7]，但只能轮换、交替或混合使用化学杀菌剂，才能取得较好的控制效果，而超量使用化学农药又导致严重的“3R”问题。

中药杀菌剂作为一种新型植物源农药，对目标生物有安全无污染的特点[8]。因此，筛选对番茄灰霉病菌具有抑制作用的中药材提取物越来越受到人们的关注，王树桐等[9-10]对10种中药材提取物进行抑菌筛选后，进一步研究了细辛、丁香提取物对番茄灰霉病菌的防治效果，王兴全等[11]发现苍耳提取物对番茄灰霉病有明显抑制作用后，初步探讨了其作用机理。目前，蛇床子、苦参、甘草、石榴皮等[12-14]数十种中药材提取物对番茄灰霉病菌的抑制作用均有研究报道，而川产道地药材对番茄灰霉病的抑菌效果研究少见报道，鉴于多种川产道地药材具有杀菌抑菌潜力，本文通过对系统筛选出的20种具有杀菌抑菌潜力的川产道地药材的乙醇、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、石油醚和水6种提取物进行番茄灰霉病菌的室内防治实验，丰富中药材提取物抑菌研究领域的数据资料，同时为最终找到新的可用于杀菌剂研发的中药材料奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

20种供试川道地药材 通过《中华人民共和国药典中药材及原植物彩色图鉴》《四川道地中药材志》《中国土农药志》《有毒中药》《中国有毒植物》等相关文献资料系统筛选，名录见表1，均购于四川省成都北京同仁堂总府路店，50℃烘干，粉碎后过0.425mm孔径筛，密封，4℃保存备用；番茄灰霉病菌（B.cinerea） 四川农业大学原子能农业应用研究室提供；无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、石油醚均为分析纯 四川西陇化工有限公司；啶酰菌胺（50%水分散粒剂） 德国巴斯夫欧洲公司；甲基硫菌灵（70%可湿性粉剂） 浙江威尔达化工有限公司；PDA培养基 杭州微生物试剂有限公司。

GHP-9050型隔水式恒温培养箱、DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；LQ-CTS1型恒温振荡器 上海琅珄实验设备有限公司；SW-CJ-1CU型洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；RE-2000B型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；MLS-3780-SV型高压蒸汽灭菌器日本三洋电机株式会社；KQ3200DA型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；BSA223S型电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DL-1型万用电炉 北京市永光明医疗仪器有限公司；FW-100型高速万能粉碎机 齐家务科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物制备

1.2.1.1 有机试剂提取 采用浸渍法[15-16]。称取9g中药干粉，加90m L有机试剂，28℃，180r/m in振荡提取24h，过滤，滤渣重复提取2次，合并3次滤液，旋转蒸发浓缩至9m L，即1m L提取物相当于1g原药，密封后保存于4℃冰箱备用。

1.2.1.2 水提取 采用煎煮法[17-18]。称取9g中药粉末，加90m L蒸馏水浸泡2h，煮沸后文火保持1h，过滤，滤渣加50m L蒸馏水重复提取2次，合并3次滤液，旋转蒸发浓缩至9m L，即1m L提取物相当于1g原药，密封后保存于4℃冰箱备用。

1.2.2 抑菌活性研究 采用菌丝生长速率法[19]。取提取物3m L，滤菌后加入27m L灭菌PDA培养基中制成质量浓度为0.1g/m L的含药平板。在平板中央接种直径为5mm的菌饼，菌丝面朝上，每个处理3次重复，接种后23℃恒温培养。以无菌水为空白对照，以对应溶剂、甲基硫菌灵（1∶800）和啶酰菌胺（1∶1000）为对照。培养7d后，采用十字交叉法测量菌落直径，并按下式计算菌丝生长抑制率：

1.2.3 数据处理 本实验数据菌落直径采取三次重复平均值±标准误（mean±SEM）表示，应用PASW Statistics 18软件进行邓肯式（Duncan）新复极差分析（One-way ANOVA）法[20]统计分析。

2 结果与分析

2.1 乙醇提取物抑菌作用

表1 供试药材名录Table1 Catalogue of tested Sichuan authentic herbalmedicine

采用生长速率法测定了20种川道地药材乙醇提取物对番茄灰霉病菌的抑制作用，结果见表2。由表2可见，在提取物质量浓度为0.1g/m L的条件下，供试药材乙醇提取物均有抑菌效果，其中抑菌率超过75%的13种供试药材具有明显相当于或优于化学杀菌剂的抑菌效果；黄柏、川射干、花椒、黄连、石菖蒲、大黄、川乌7种供试药材抑菌率为100%，抑菌效果显著性高于抑菌率为92.22%的甲基硫菌灵；金银花抑菌效果显著性高于抑菌率为82.35%的啶酰菌胺；川木通、桔梗、半夏、川楝子、续断5种供试药材抑菌效果与啶酰菌胺无显著性差异；乙醇与无菌水对照无显著性差异，说明本实验条件下无水乙醇无抑菌作用。

2.2 乙酸乙酯提取物抑菌作用

采用生长速率法测定了20种川道地药材乙酸乙酯提取物对番茄灰霉病菌的抑制作用，结果见表3。由表3可见，在提取物质量浓度为0.1g/m L的条件下，供试药材乙酸乙酯提取物均有抑菌效果，其中7种供试药材抑菌效果显著性高于抑菌率为83.18%的啶酰菌胺；川射干、黄连、桔梗、石菖蒲、川乌、使君子抑菌率为100%，抑菌效果显著性高于抑菌率为95.60%的甲基硫菌灵；乙酸乙酯对照组在本实验条件下无抑菌作用。

2.3 丙酮提取物抑菌作用

采用生长速率法测定了20种川道地药材丙酮提取物对番茄灰霉病菌的抑制作用，结果见表4。由表4可见，丙酮对照组具有一定的抑菌作用，抑菌率为17.87%，与使君子、巴豆、半夏、金钱草、附子、桔梗、川木通无显著性差异，表明该7种供试药材丙酮提取物无抑菌作用；丙酮对照组抑菌率显著高于白芍、川牛膝、泽泻，表明该3种供试药材丙酮提取物在本实验条件下对番茄灰霉病菌略有促进生长作用；在提取物质量浓度为0.1g/m L的条件下，石菖蒲的抑菌率为100%，显著高于抑菌率为92.65%的甲基硫菌灵；大黄抑菌率为87.86%，显著高于抑菌率为82.66%的啶酰菌胺，与甲基硫菌灵无显著性差异；川射干抑菌效果与啶酰菌胺无显著性差异，以上3种供试药材抑菌效果较为显著。

2.4 三氯甲烷提取物抑菌作用

表2 20种川产道地药材乙醇提取物对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用Table2 Inhibitory effects of 20 species of alcoholic extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

表3 20种川产道地药材乙酸乙酯提取物对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用Table3 Inhibitory effects of 20 species of ethyl acetate extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

采用生长速率法测定了20种川道地药材三氯甲烷提取物对番茄灰霉病菌的抑制作用，结果见表5。由表5可见，在提取物质量浓度为0.1g/m L的条件下，供试药材三氯甲烷提取物均有抑菌效果，三氯甲烷抑菌率为8.94%，不影响供试药材抑菌效果的对比；续断、金银花抑菌率为100%，抑菌效果显著高于甲基硫菌灵；石菖蒲抑菌效果与甲基硫菌灵无显著性差异；半夏抑菌效果显著高于啶酰菌胺；黄连抑菌效果与啶酰菌胺无显著性差异，以上5种供试药材抑菌效果显著。

表4 20种川产道地中药材丙酮提取物对番茄灰霉菌菌丝生长的抑制作用Table4 Inhibitory effects of 20 kinds of acetonic extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

表5 20种川产道地药材三氯甲烷提取物对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用Table5 Inhibitory effects of 20 species of trichloromethane extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

2.5 石油醚提取物抑菌作用

采用生长速率法测定了20种川道地药材石油醚提取物对番茄灰霉病菌的抑制作用，结果见表6。由表6可见，在提取物质量浓度为0.1g/m L的条件下，供试药材石油醚提取物除泽泻外均有抑菌效果，但20种供试药材石油醚提取物抑菌率均低于80%，效果均显著低于甲基硫菌灵，只有石菖蒲抑菌效果较强，为79.04%，与啶酰菌胺无显著性差异；由于石油醚具有强烈的挥发性，在本实验条件下表现出较弱的抑菌效果，从而不影响各处理组实验结果的比较。

2.6 水提取物抑菌作用

采用生长速率法测定了20种川道地药材水提取物对番茄灰霉病菌的抑制作用，结果见表7。由表7可见，在提取物质量浓度为0.1g/m L的条件下，供试药材水提取物除使君子、巴豆表现出较弱的促进作用外均有一定的抑菌效果，但20种供试药材水提物的抑菌作用均显著低于啶酰菌胺与甲基硫菌灵，抑菌率均在80%以下。

3 结论与讨论

乙醇提取物中黄柏、川射干、花椒、黄连、石菖蒲、大黄、川乌、金银花，乙酸乙酯提取物中川射干、黄连、桔梗、石菖蒲、川乌、使君子，三氯甲烷提取物中续断、金银花，丙酮提取物中石菖蒲对番茄灰霉病菌均有显著的抑制作用，在供试浓度为0.1g/m L的条件，实验测量抑菌率为100%。

前人对以上部分药材提取物成分也做过一定研究，例如黄柏乙醇提取物中主要化学成分为γ-花椒碱、茵芋碱、铁屎米酮等[21]，汉源花椒精油主要含D-柠檬烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯等[22]，石菖蒲的主要抑菌成分有α-细辛醚，细辛醛[23]等，但对供试药材提取物具体抑菌成分分析及对番茄灰霉病菌等蔬菜病原真菌的抑菌效果研究的很少，能进一步研发为中药杀菌剂的几乎没有，因此在本实验基础上，对以上具有显著抑菌作用的供试药材作抑菌成分分析，或研究配伍抑菌效果，并进一步研发中药杀菌剂是可行的。

表6 20种川产道地药材石油醚提取物对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用Table6 Inhibitory effects of 20 species of petroleum ether extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

表7 20种川产道地药材水提取物对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用Table7 Inhibitory effects of 20 species of aqueous extracts of Sichuan authentic herbalmedicine onmycelial growth of Botrytis cinerea

通过6种溶剂提取物抑菌实验结果来看，由于各种溶剂提取的极性部位不同，使得提取溶剂的选择对供试药材提取物抑菌效果有显著的影响。石油醚、氯仿提取的是小极性部位，乙酸乙酯适于提取中等极性部位，乙醇、丙酮适于提取极性很大的苷类、糖类、氨基酸与某些生物碱[9]。水提物因煎煮温度高导致破坏活性物质，糖分含量高导致浓缩后易凝聚沉淀等因素造成抑菌效果较差。因此，在中药材提取物室内抑菌实验中，根据中药材成分选择适当的溶剂有利于提高筛选效果。

目前，生产中单一和过量用药都有利于病菌抗药性的产生。灰葡萄孢菌是典型的易产生抗药性的病菌。目前市面上，针对它的杀菌剂主要有苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、苯胺基嘧啶类、咯菌腈等。但已有报道指出番茄灰霉病菌对这些杀菌剂产生了不同程度的抗药性[24]。本实验结果表明，川道地药材黄柏、川射干、花椒、黄连、石菖蒲、大黄、川乌、金银花、桔梗、使君子、续断等均可用于防治番茄灰霉病的中药杀菌剂研发。

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