不同菌种比例对发酵桑叶茶生物活性成分含量的影响

肖 洪，黄先智，丁晓雯，*，沈以红，张亚琼，梁菡峪，张 迪，丁顺杰

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工重点实验室，重庆400715；2.西南大学蚕学与生物系统研究所，重庆400715；3.家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆400715）

桑叶茶（Mulberry-leaf Tea）是由桑叶加工制作而成的新型茶品，目前一般采用直接烘干或自然发酵的方式生产。桑叶绿茶甘醇香甜；桑叶乌龙茶爽口醇和，有淡淡的花香；桑红茶甘甜醇厚，有近似香蕉的果香味[1]。但桑叶绿茶普遍存在汤色发黑，豆腥味重，感官品质不佳的问题，为此，人们尝试开发桑叶乌龙茶、红茶等产品。桑叶茶的主要功能成分包括生物碱、茶多酚、花青素、绿原酸、白藜芦醇、氧化芪三酚、β-胡萝卜素等生物活性物质[2-3]。桑叶茶的矿物元素含量比茶叶高出3～6倍；总糖、酚类物质、氨基酸含量都较高；同时桑叶叶面较薄，比茶叶易溶解出更多的有效成分，有利于人体的吸收[4]。脱氧野尻霉素（Deoxynojirimycin，DNJ）是一种极性含N化合物，其化学名称为3，4，5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式为C6H13NO4，相对分子质量为163[5-6]，是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有降血糖[7-8]、降血脂[9-10]、抗肿瘤[11]、抑制变形链球菌生长[12]、抗病毒[13]等功效。桑叶是植物中DNJ含量比较高的，但不同叶位、加工工艺等诸多因素都可能影响到桑叶茶中DNJ的含量[14-15]。黄酮类物质是一类天然的抗氧化剂，能够清除人体中超氧离子、氧自由基、脂质过氧化物、过氧化氢及酶类所不能清除的羟自由基等，具有降血压、抗氧化、防癌，抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂等生理作用[16]。桑叶中含有的多糖具有显著的降血糖作用[17]，可以抑制α-葡萄糖苷酶和猪胰液α-淀粉酶的活性[18]等作用。前期实验探究了不同菌种单独或组合人工接种发酵对桑叶茶中DNJ、黄酮、多糖、多酚等主要功能成分含量的影响。发现黑曲霉、日本根酶、绿色木霉复合发酵制得的桑叶茶综合品质好，本文以不同黑曲霉、日本根酶、绿色木霉菌种比例发酵桑叶茶，分析不同菌种比例对发酵桑叶茶中DNJ、黄酮、多糖、多酚4种功能成分含量变化，为桑叶的深度开发利用提供数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉（AsPergillus niger） GSICC 60108，甘肃省微生物菌种保藏中心；日本根霉（Rhizopus japonicus Vuillem in） GIM 3.119，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；绿色木霉（Trichoderma viride）GIM 3.443，广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心（注以上三种菌种的安全等级均高，其生物危害程度为四类，在通常情况下不会引起人类或者动物疾病）；自然发酵、人工发酵桑叶茶 由本实验室自制；DNJ标准品 北京德威钠生物技术有限公司；甘氨酸（Gly）、9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl） Sigma公司；乙腈 色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司；没食子酸标准品 中国药品生物制品检定所；芦丁标准品 北京德威钠生物技术有限公司；其他常用试剂 均为分析纯。

Waters 1525 HPLC 美国Waters公司；5810型台式高速离心机 德国Eppendorf公司；Spectrum lab 22可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；KQ5200DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵桑叶茶的制备 采摘从顶芽往下数4～10片的新鲜桑叶，去柄，切为4cm×4cm的小叶片，混匀后称取100g叶片用微波杀青90s，揉捻，根据中心组合设计，设置黑曲霉∶日本根酶∶绿色木霉为1∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2六种比例，加入107cfu的不同比例的黑曲霉+日本根酶+绿色木霉菌液10m L（自然发酵只加10m L无菌水），复揉，28℃发酵5h，微波干燥，制得桑叶茶。

1.2.2 DNJ的测定

1.2.2.1 测试样品的制备 取桑叶茶粉末0.5g，加入一定量超纯水，80℃水浴浸提2h（每20min摇匀一次），抽滤后，滤渣再加水浸提2次。合并浸提液，用超纯水定容至50m L，即得样品提取液。

1.2.2.2 DNJ的衍生化及测定方法 按照参考文献[19]进行。色谱条件：色谱柱：C18柱（150mm×4.6mm×5μm）；流动相：乙腈-0.1%醋酸（50∶50，V/V）；流速：1.0m L/min；柱温25℃；进样量10μL；紫外检测器，检测波长254nm。

1.2.3 黄酮测定 取桑叶茶粉末0.5g于50m L离心管中，加70%乙醇15m L，80℃水浴160W功率超声提取15min，7000r/min离心5min，抽滤，得到滤液。如此共提取3次，滤液用70%的乙醇定容至50m L。吸取1.0m L滤液，用AlCl3比色法[20]测定。

1.2.4 多糖测定 取桑叶茶粉末0.250g于兰盖瓶中，加入20m L沸蒸馏水，在200W功率下55℃超声提取20m in，将提取液过滤后定容至25m L。取1.0m L滤液用苯酚-硫酸法[21]测定多糖含量。

1.2.5 多酚测定 按照GB/T 8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法[22]进行测定。

1.3 数据统计与分析

各实验至少重复3次以上，实验数据用Excel和SPSS 16进行统计处理。

2 结果与讨论

2.1 各活性成分标准曲线线性回归方程及相关系数

按照1.2.2的实验方法，对不同浓度DNJ标准溶液进行测定，得到DNJ的标准曲线线性回归方程为y= 15776x-70392，相关系数r=0.9996。式中x为DNJ浓度，μg/m L；y为峰面积。

按照1.2.3实验方法，测定不同浓度芦丁标准溶液的吸光度，得到芦丁标准曲线线性回归方程为y= 11.622x-0.0031，相关系数r=0.9997。式中，x为芦丁浓度，μg/m L；y为吸光度。

按照1.2.4的实验方法，测定不同浓度葡萄糖标准溶液的吸光度，得到葡萄糖的标准曲线线性回归方程为y=10.909x-0.0021，相关系数r=0.9998。式中，x为葡糖糖的浓度，μg/m L；y为吸光度。

按照1.2.5的实验方法，测定不同浓度没食子酸标准溶液的吸光度，得到没食子酸的标准曲线线性回归方程为y=0.0208x+0.0034，相关系数r=0.9998。式中，x为没食子酸的浓度，μg/m L；y为吸光度。

实验结果表明，各标准曲线的相关系数均大于0.9990，线性关系良好，可用于样品中相关活性成分的测定。

2.2 DNJ标准品和样品的色谱图

将DNJ经衍生化后上高效液相色谱仪进行测定，得到如图1～图3所示的色谱图。

图1 空白色谱图Fig.1 Chromatogram of blank sample

图2 DNJ标准品色谱图Fig.2 Chromatogram of DNJstandard

图3 桑叶茶样品色谱图Fig.3 Chromatogram ofmulberry-leaf tea sample

由色谱图2可知，在本实验条件下，DNJ衍生物DNJ-FMOC的保留时间为2.731m in，与Gly-FMOC和FMOC-OH的峰间距分别相差2.719min和4.243min，表明这两种物质均不干扰DNJ的测定。

2.3 不同菌种比例对发酵桑叶茶中DNJ含量影响

分别在不同比例下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+绿色木霉菌液10m L，在28℃发酵5h生产桑叶茶，探究其DNJ含量的变化。实验结果如图4所示。

由图4可知，与自然发酵比较，所有菌种比例发酵后DNJ含量均增加，其中黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为1∶2∶1、2∶1∶2、1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2发酵的桑叶茶中DNJ含量分别为147.8、151.3、148.4、145.7、142.5、 149.7mg/100g干重，比自然发酵分别增加了6.43%、8.94%、6.85%、4.93%、2.61%、7.82%，与自然发酵比较，以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为1∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶2发酵的桑叶茶中DNJ含量无显著性差异（p＞0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为2∶1∶2、1∶1∶1、1∶2∶2发酵后的桑叶茶中DNJ含量有显著性差异（p＜0.05），特别是黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为2∶1∶2发酵后的桑叶茶中DNJ含量最高达151.3mg/100g干重，这可能是黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为2∶1∶2时更利于这3种菌种相互协同作用，利用桑叶茶中的营养物质从而产生DNJ。

图4 不同发酵比例对发酵桑叶茶中DNJ含量影响Fig.4 The contentof DNJofmulberry-leaf tea by different fermentation strains rate

2.4 不同菌种比例对发酵桑叶茶中黄酮含量影响

分别在不同比例的下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+绿色木霉菌液10m L在28℃发酵5h生产桑叶茶，探究其黄酮含量的变化。实验结果如图5所示。

图5 不同发酵比例对发酵桑叶茶中黄酮含量影响Fig.5 The contentof flavonoid ofmulberry-leaf tea by different fermentation strains rate

由图5可知，与自然发酵比较，其中以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为1∶2∶1时黄酮含量为4.22g/100g干重，增加了1.16%，无显著性差异（p＞0.05）。以2∶1∶2、1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2比例发酵的桑叶茶中黄酮含量均降低，以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉=1∶1∶2发酵的桑叶茶中黄酮含量为3.99g/100g干重，仅降低了4.24%，无显著性差异（p＞0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为2∶1∶2发酵桑叶茶中黄酮含量降低了8.98%，有显著性差异（p＜0.05）；以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶2发酵的桑叶茶中黄酮含量分别为3.53、3.71、3.76g/100g干重，与自然发酵比较分别降低了15.39%、10.98%、9.73%，均具有极显著差异（p＜0.01）。可能是由于黑曲霉、日本根霉、绿色木霉3种菌相互作用，当在黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为1∶2∶1时利于桑叶茶中黄酮的产生，而其他5种比例时不利于黄酮的产生，反而要利用和分解桑叶茶中的黄酮，或有可能生成了其他有色物质。

2.5 不同菌种比例对发酵桑叶茶中多糖含量影响

分别在不同比例的下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+绿色木霉菌液10m L在28℃发酵5h生产桑叶茶，探究其多糖含量的变化。实验结果如图6所示。

图6 不同发酵比例对发酵桑叶茶中多糖含量影响Fig.6 The contentof polysaccharid ofmulberry-leaf tea by different fermentation strains rate

由图6可知，与自然发酵比较，其中以各比例的黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉发酵的桑叶茶中多糖含量均降低，其中以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉=1∶2∶1发酵的桑叶茶中多糖含量为12.15g/100g干重，降低了6.78%，无显著性差异（p＞0.05）；以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2发酵的桑叶茶中多糖含量分别为11.85、11.99、11.78g/100g干重，分别降低了9.12%、8.01%、9.64%，与自然发酵比较具有显著性差异（p＜0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为2∶1∶2、1∶2∶2发酵的桑叶茶中多糖含量分别为11.30、11.68g/100g干重，与自然发酵比较分别降低了13.30%、10.43%，具有极显著差异（p＜0.01）。这可能是因为不同菌种比例的黑曲霉、日本根霉、绿色木霉相互作用后，分解利用了桑叶茶中的多糖，从而利于桑叶茶中其他活性成分的形成。

2.6 不同菌种比例对发酵桑叶茶中茶多酚含量影响

分别在不同比例的下加入107cfu黑曲霉+日本根霉+绿色木霉菌液10m L在28℃发酵5h生产桑叶茶，探究其多酚含量的变化。实验结果如图7所示。

由图7可知，与自然发酵比较，以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉=1∶2∶1发酵的桑叶茶中多酚含量为0.66g/100g干重，多酚含量仅增加了1.68%，无显著性差异（p＞0.05）；其余所有比例发酵的桑叶茶中多酚含量均降低，其中黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉=2∶1∶2发酵的桑叶茶中多酚含量为0.61g/100g干重，多酚含量下降了6.26%，与自然发酵比较有显著性差异（p＜0.05）；而以黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉为1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2发酵的桑叶茶中多酚含量分别为0.54、0.58、0.57、0.49g/100g干重，与自然发酵比较分别下降了16.04%、9.76%、12.60%、23.90%，具有极显著性差异（p＜0.01）。可能是发酵过程中黑曲霉、日本根霉、绿色木霉3种菌相互作用，当比例为1∶2∶1时利于桑叶茶中多酚的形成，而其他5种比例时桑叶茶中的大量多酚类化合物被氧化聚合成有色物质。

3 结论

通过上述研究结果的分析发现，黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉=1∶2∶1发酵的桑叶茶中DNJ增加6.43%，黄酮增加1.16%，多糖降低6.78%，多酚增加1.68%，综合品质好。而用黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉=2∶1∶2发酵的桑叶茶中DNJ增加8.94%，为最高，其中DNJ是桑叶茶中最主要的功能性成分。因此，认为黑曲霉∶日本根霉∶绿色木霉=2∶1∶2是在所用的实验菌种比例中保证发酵桑叶茶功能性质最好的菌种。

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