不同厂家试剂检测亮氨酸氨基肽酶的方法比对

沃燕波，邹继华，黄幸雷，张桂春，马葵芬

(1、宁波美康生物科技股份有限公司，浙江宁波315100；2、浙江大学医学院附属第一医院，浙江杭州310003)

不同厂家试剂检测亮氨酸氨基肽酶的方法比对

沃燕波1，邹继华1，黄幸雷1，张桂春1，马葵芬2

(1、宁波美康生物科技股份有限公司，浙江宁波315100；2、浙江大学医学院附属第一医院，浙江杭州310003)

目的对不同厂家试剂检测亮氨酸氨基肽酶(LAP)结果的可比性及偏倚进行评估。方法依照美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP9-A2文件规定，连续5 d收集不同浓度范围分布的40个新鲜血清标本，使用5个不同厂家LAP试剂，每个标本均按正反顺序重复两次，记录测定结果，检查离群点、计算线性方程及相关系数，并对其进行偏倚评估。结果各厂家试剂与Randox试剂方法间的相关性良好(r＞0.975)，但仅美康和利德曼试剂与Randox试剂检测结果的预期偏倚小于允许误差。结论各厂家的试剂与Randox试剂检测结果相关性良好，但检测结果并不完全一致。

亮氨酸氨基肽酶；方法比对；偏倚评估

亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase，LAP)是一种蛋白分解酶，能水解肽链N端以及由亮氨酸与其它氨基酸所形成的肽键，广泛分布于肝、胰和肾等组织中，当这些组织发生病变时其水平升高[1]。研究显示，LAP对胆汁淤积性肝炎、胆道梗阻及胰腺癌的诊断有价值，其肝癌的检出阳性率较腺苷脱氨酶高，诊断肝脏疾病比谷氨酰基转移酶更灵敏，其也可早期反映肾损害的性质和程度，为临床鉴别肾小球、肾小管损伤提供帮助，其还可作为妊娠期肝内胆汁淤积症及孕妇和胎儿健康情况动态监测的一项指标[2-4]，因此必须重视其检测结果的正确性。为此，我们按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)指南文件EP9-A2要求对5个不同厂家LAP试剂检测结果进行了比对和偏倚评估[5-7]，以了解不同厂家试剂在检测LAP时是否存在差异以及测定结果的可比性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本收集参照文件[5]，收集日常进行LAP检测的新鲜、无溶血、无黄疸、无乳糜血清标本40份，储存于4℃冰箱。

1.1.2 LAP试剂购自Randox公司(批号：241695)、日本和光公司(批号：TR370)、北京利德曼公司(批号：204241A)、温州伊利康公司(批号：111003)、宁波美康生物科技股份有限公司(批号：20120810)。

1.1.3 仪器日立7180全自动生化分析仪。

1.2 方法

1.2.1 样本测定每天收集检测范围均匀分布的8份患者新鲜血清，连续5d，共40份样本。每份样本都用5种试剂各自进行双份测定，测定顺序依1～8测定第1次，再按反序8～1测定第2次，以减少交叉污染及漂移对重复测定标本平均值的影响，顺序中的浓度应尽可能随机排列。同一标本均在2 h内完成两法的测定。

1.2.2 离群值检查根据文件[5]，对各系统内和方法间进行组内与组间离群值检查。

1.2.3 作图及线性关系的目测检查散点图1：Y轴为实验方法每样本双份测定的均值(Yi)；X轴为比较方法每样本份测定的均值(Xi)。散点图2：Y轴为实验方法每样本双份测定值(Yij)；X轴为参比方法每样双份测定的均值(Xi)。偏倚图1：Y轴为(Yi-Xi)；X轴为(Yi+Xi)/2，以直线X=0作水平中线作图。偏倚图2：Y轴为(Yij-Xi)；X轴为(Yi+Xi)/2，以直线X=0作为水平中线作图。据图目测评价图的相对线性、足够范围和离散的均匀性。

1.2.4 X值合适范围的检验根据文件进行相关系数计算[5]，如果r≥0.975，则认为X范围适合，数据满足要求。X的误差可以由数据范围给以适当补偿，并且简单的线性回归可以用来评价斜率和截距。

1.2.5 线性回归分析根据文件[5]，计算两个方法间的线性回归方程：Y=a+bX。

1.2.6 预期偏倚及可信区间计算根据文件[5]，在医学决定水平，利用回归方程计算预期偏倚及95%可信区间，以预设的允许误差10%为限，将预期偏差的可信区间与之进行比较，当预期偏差可信区间的下限＜允许误差＜预期偏差可信区间的上限时，实验方法与比对方法相当；当预期偏差可信区间的上限＜允许误差时，实验方法与比对方法相当，偏差可接受；预期偏差可信区间的下限＞允许误差时，实验方法与比对方法不相当，偏差不可接受。

1.3 统计学方法所有数据用Excel软件进行统计处理、作图分析及偏差评估计算。

2 结果

2.1 散点图、偏倚图分析以国际著名诊断试剂厂家Randox试剂检测系统的测定结果为X，其余各厂家试剂的检测结果为Y，经组内、组间离群值检验后，作散点图和偏倚图；从散点图中可以较为直观地看出各厂家的试剂与Randox试剂方法间的线性关系良好。如图1、2为美康试剂与Randox试剂的散点图，目测可见美康试剂LAP测定值与Randox试剂LAP测定值呈直线关系，说明两方法相关性较好。偏倚图1、2分别检查的是两种方法重复测定均值间的差异和两种方法测定值间的差异，反映两种方法间是否存在系统误差，从作图结果来看，美康、利德曼试剂分别与Randox试剂测定同一份血清时差值较小，分布较为合理，而和光试剂测定值普遍高于Randox试剂，伊利康试剂测定值普遍低于Randox试剂，说明两方法间结果存在差异，并且待测标本的浓度越高，这种差异越大。图3、4示美康试剂与Randox试剂的偏倚图。图5、6示和光试剂与Randox试剂的偏倚图。

2.2 X值合适范围的检验及线性回归分析结果如表1所示，各厂家的试剂与Randox试剂的r＞0.975，说明测定范围足够宽，误差的影响可以忽略不计，也说明回归统计的斜率b和截距a可靠。

图1 LAP重复测定均值的散点图

图2 LAP各次测定结果的散点图

图3 LAP重复测定均值偏差图

图4 LAP各次测定结果偏差图

图5 LAP重复测定均值偏差图

图6 LAP各次测定结果偏差图

表1 相关系数及直线回归方程

2.3 偏差估计计算预期偏差及其可信限范围，根据EP9-A2文件提供的公式[5]，并选择60 U/L作为LAP的医学决定水平[8,9]，对预期偏倚及可信区间进行计算，判断两种检测方法是否相当。我们以预设的允许误差10%为限，按照“二分之一允许误差”的标准[6]，计算得其允许偏倚为3 U/L，由回归方程计算的预期偏差见表2，结果显示，美康和利德曼试剂的预期偏差95%可信区间上限＜3 U/L，说明其与Randox试剂偏倚可接受，试剂间检测结果具有良好的可比性，而和光和温州伊利康试剂的预期偏差95%可信区间下限＞3 U/L，说明其测定结果与Randox试剂测定结果间的差异较为显著，超出了预设的允许误差范围，方法间所得的检测结果不一致。

表2 预期偏倚及可信区间的比较

3 讨论

LAP位于细胞的微粒体内，在肝脏主要定位于毛细胆管上皮细胞，不同肝病其活性增高程度不同，由高至低为依次肝癌、急性肝炎、肝硬化、慢性肝炎，其中肝癌阳性检出率最高，因此，LAP作为肝癌鉴别诊断的一项初步指标，值得推广[1]。此外，由于LAP不像其他肝功能酶，只能检测血液样本，其还可以检测尿液，在一些病例中可以不必采血而进行检验，因此应用起来十分方便[10]。本实验根据CLSI EP9-A2文件的流程[5-7]，对市场上5个厂家试剂的测定结果进行比对，结果显示，各厂家试剂的检测结果的重复性均较好，没有方法内和方法间离群值，当以国际著名诊断试剂厂家Randox试剂的检测系统为比较方法时，其余各厂家试剂与其的线性关系良好，说明各厂家试剂与Randox试剂的相关性较好。进一步我们通过偏差估计发现，美康和利德曼试剂与Randox试剂偏倚可接受，说明美康和利德曼试剂与Randox试剂的检测结果具有良好的可比性，而和光和温州伊利康试剂测定结果与Randox试剂测定结果间的差异较为显著，由回归方程计算的预期偏差超出了预设的允许误差范围，可见，和光和温州伊利康试剂与Randox试剂所得的检测结果不一致。由于目前还没有LAP的参考物质，且还未制定出参考测量程序，因而尚难对各厂家测定结果的正确性做出判断，但根据本研究的图形分析及相关回归分析可知，各试剂在检测范围内相关性良好，因此根据回归方程对检测结果进行系数调整，可使方法间测定结果具有一致性与可比性。

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Method comparision of the kits from different manufactures in detecting of Leucine aminopeptidase

WO Yanbo,ZOU Ji- hua,HUANG Xinglei,et al.Ningbo Medicalsystem Biotechnology Co.,Ltd,Zhejiang Ningbo 315100，China

ObjectiveTo assess the comparability and bias of the LAP test results detected with leucine aminopeptidase(LAP) reagent from different manufacturers.Methods According to US National Clinical Laboratory Standards Committee(CLSI)EP9-A2, forty fresh serum samples covering different concentrations were continuously collected for 5 days.The collected samples were detected using LAP reagents made by 5 different manufacturers.Each sample was measured twice with the positive and negative order.The results were recorded to check the outliers and to calculate the linear equations and correlation coefficients,and to estimate the bias.Results The correlation between the tested reagents made by different manufacturers and Randox reagent was good (r＞0.975).Compared with Randox reagent,the expected bias of the results detected with the reagents manufactured by Meikang and Lideman was less than the allowable error region.Conclusion Though the correlation of the tested reagents is good,the detection results are not consistent.

Leucine aminopeptidase;Method comparison;Bias estimation

R446.11+2

A

1674-1129(2013)01-0010-3

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.004

浙江省中医药科学研究基金(No 2011ZA053)

沃燕波，女，1980年生，毕业于浙江大学，医学博士，中级工程师，从事体外诊断试剂开发研究。