利用西瓜种子检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

肖璐,李玲,唐炎英,戴思慧,王军辉,刘泽发,孙小武

(1.湖南农业大学园艺园林学院,长沙,410128；2.湖南省瓜类研究所；3.湖南人文科技学院)

利用西瓜种子检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

肖璐1,李玲1,唐炎英1,戴思慧1,王军辉2,刘泽发3,孙小武1

(1.湖南农业大学园艺园林学院,长沙,410128；2.湖南省瓜类研究所；3.湖南人文科技学院)

以疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）的西瓜植株上收取的种子为材料,提取总RNA为模板进行RT-PCR扩增,并对电泳后的目标条带进行回收测序,将测序结果提交genebank与已知序列比较,结果显示所扩增序列为CGMMV外壳蛋白（CP）基因中的一个片段,说明此方法可以成功检测出西瓜种子携带的CGMMV,可作为一种快速检测西瓜种子是否携带CGMMV的方法。

西瓜种子；黄瓜绿斑驳花叶病毒；RT-PCR

中国是世界西甜瓜第一生产大国,西甜瓜播种面积每年约230万hm2,主产区遍布全国20多个省、自治区、直辖市[1]。并且自20世纪80年代中期以来,西甜瓜生产一直是我国许多地方农民经济收入增加的重要来源。CGMMV是烟草花叶病毒属葫芦科植物的重要病毒之一,对葫芦科作物生产造成严重威胁[2～5]。2006年我国农业部(农业部公告第788号)已将该病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物。由于种子带毒是CGMMV传播的主要途径,而种子是农业生产中不可替代的生产资料。因此,加强西甜瓜种子的安全生产,建立健全种子病毒检测方法,杜绝带毒劣质种子上市,从源头控制CGMMV的扩散蔓延有重要意义。CGMMV的检测方法有多种且均较为成熟,各有各的优点,但以西瓜种子为检测材料还未见报道。本研究以从感染CGMMV的西瓜植株上采集的种子为试验材料,并应用优化的RT-PCR进行检测鉴定,最终能够扩增出与目标片段大小一致的条带,将目标条带进行回收测序,测序结果显示扩增出的片段是CGMMV外壳蛋白(CP)基因的一段序列。本试验为种子生产企业在CGMMV的诊断与快速检测提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料的获得

于2012年6月在山东发现疑似感染CGMMV的西瓜植株,待果实成熟后采集该植株果实并取种用于CGMMV的检测。

1.2 试剂

大肠杆菌DH 5a为本实验室保存、TRIZOL购自迈科为公司、Pmd18-T、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4DNA连接酶、D2000 DNA Maker等购自天根公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；M-mLV逆转录酶购自Invitrogen公司；琼脂糖为BIO-WEST公司生产；其余试剂为国产分析纯。

1.3 引物

RT-PCR使用白静等[6]设计的可成功检测南瓜果实CGMMV的引物,上游引物CGMMV-cpf: 5'-ATGGC'VFACAATCCGATCAC-3',下游引物CGMMV-cpr:5'-CTAAGCTVFCGAGGTGGTAGC-3',预期目标片段493 bp。

1.4 叶片与种子总RNA提取及RT-PCR

取西瓜种子一粒或叶片0.5 g置于研钵内,加液氮研磨成粉,按TRIZOL法提取总RNA。方法如下:液氮研磨西瓜种子或叶片至匀浆,加1 mL Trizol,移入1.5 mL离心管中,加500 μL氯仿异戊醇剧烈震荡15 s冰浴10 min,室温12 000 r/min离心15 min；取上清液入新离心管,加等体积氯仿异戊醇混匀,重复2次；取上清液入新离心管,加500 μL异丙醇,轻微混匀,室温放置10 min,12 000 r/min离心10 min(4℃)；弃上清液,加入1 mL 80%乙醇(用DEPC水配制),混匀,室温7 500 r/min离心5 min；弃上清液,1 mL无水乙醇洗涤,7 500 r/min离心5 min(4℃)；弃上清液,风干,加30～50 μL无菌水完全溶解。

反转录体系:体系(20 μL),模板RNA 2 μL,下游引物CGMMV-cpr(10 mmol/L)2 μL,RNase-Free H2O 9 μL,70℃变性10 min,冰上放置5 min,再依次加入5×buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTP 2 μL,M-mLV反转录酶1 μL,42℃恒温1 h,70℃5 min。

PCR扩增体系:取2 μL cDNA作为模板,10×buffer(含Mg2+) 3 μL,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL, DNA聚合酶0.5 μL,加无菌水14.5 μL,总体积为25 μL,扩增条件为95℃变性3 min；95℃变性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸30 s,循环30次；72℃,10 min；4℃保存。反应结束后对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统检测拍照。

1.5 检测结果的确定

为进一步确定扩增条带是否为黄瓜绿斑驳花叶病毒CP基因某一片断,将PCR目的电泳条带进行回收,操作过程参照试剂盒说明书。回收的PCR产物与PMD18-T连接,连接产物转化大肠杆菌,用Amp抗性培养基法进行蓝白斑筛选,阳性克隆经菌落PCR确认后将菌液送交上海生工测序,对测定的序列提交genebank进行blast比较。

2 结果与分析

2.1 疑似感病植株症状观察

疑似感病植株种植于大棚内,整个大棚内的植株均有相同症状发生(图1)。其症状表现为:全株性或系统性特征,叶片产生轻微的浅黄色斑纹,果实成熟后剖开观察病果呈暗花红色水瓤样。与其他没有症状大棚的植株比较,疑似感病植株明显较矮。

图1 疑似感病植株的叶片与果实

2.2 材料带毒检测及确定

从疑似感毒植株收获100粒种子进行RTPCR病毒检测,以没有感病症状的西瓜植株采集的种子作阴性对照。检测结果显示,疑似感病西瓜种子均能扩增出接近500 bp大小的目标条带,而阴性对照没有扩增出条带(图2)。随机选取10个阳性进行目标条带回收及测序,将测序结果提交genebank进行blast比较。结果表明,随机选取的10个样品的目标条带测序结果相同且为黄瓜绿斑驳花叶病毒CP基因中的一个片段,因此可以确定RT-PCR可成功检测西瓜种子是否带毒。

3 结论与讨论

CGMMV是种传病毒且极易通过汁液摩擦、叶片接触、嫁接、农事操作等非介体传播[7],因此加强种子检验检疫规程制定和监管,杜绝一切带毒种子出现在田间是防止CGMMV扩散的第一道屏障。

图2 RT-PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳

本文研究了利用RT-PCR方法检测疑似感染CGMMV植株的种子带毒情况,在有限样本量的情况下检测种子带毒率为100%。为进一步验证此方法的准确性和实用性,应增加检测的样本量及确定能检测出单粒种子带毒的最大种子量。相比较其他检测方式,无论是从经济效益还是准确可靠性考虑,RT-PCR检测方法所具有的检测灵敏度高、简便快速及花费少等优点都使其在对CGMMV的检验检疫中具有较大的应用价值。因此,规范及标准化整个检测流程,对种子生产企业的种子安全生产具有极大的意义。

[1]孙小武,马跃.进一步加强品种及种子管理,确保西瓜甜瓜生产安全[J].中国瓜菜,2011,24(1):58-59.

[2]陈红运,赵文军,程毅,等.辽中地区西瓜花叶病病原的分子鉴定[J].植物病理学报,2006,36(4):306-309.

[3]周玲玲,吴元华,赵秀香,等.黄瓜绿斑驳花叶病毒生物学特性及对西瓜生长的影响[J].沈阳农业大学学报,2008, 39(4):417-422.

[4]Lee K Y,Lee B C,Park H C.Occurrence of cucumber green mottle mosaic virus disease of watermelon in Korea [J].Korea J Plant Pathol,1990,6:250-255.

[5]Park J W,Cheon J U,Choi H S.Occurrence and control of seed-borne plant viruses in Korea[C]//Crop Prot Res Rural Development Administration,2001:194-218.

[6]白静.黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒及南方菜豆花叶病毒的分子检测技术研究[D].沈阳:沈阳农业大学, 2007.

[7]张永江.黄瓜绿斑驳花叶病毒研究进展[J].河南农业科学, 2006(8):9-12.

Utilizing Watermelon Seeds for Detection of Cucumber Green Mottle Mosaic Virus

In the paper,we took the seeds harvesting from watermelons which were suspected of being infected with cucumber green mottle mosaic virus(CGMMV)as material,and extracted total RNA for RT-PCR amplification,then we recycled and sequenced the target bands,and submitted the sequencing results to genebank.The results showed that the amplified sequence was a fragment of the CGMMV coat protein(cp)gene,which indicated that the method used in the test could successfully detect whether the watermelon seeds carrying CGMMV or not,and the method was a rapid method of detecting CGMMV of watermelon seeds.

Watermelon seeds；Cucumber green mottle mosaic virus；RT-PCR

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.02.028

西甜瓜现代农业产业体系,湖南省教育厅项目（11C0708）

肖璐（1988-）,男,在读硕士研究生,研究方向蔬菜学,电话:13677369121,E-mail:spellboss@163.com

孙小武,男,通信作者,博士生导师, E-mail:sunxiaowu2007@126.com

2012-10-24