大肠癌组织中BORIS表达及其与临床病理因素的关系

于海明，周杜娟，刘展，李毅妮，周震

（湖南师范大学第一附属医院,湖南省人民医院,湖南 长沙 410005）

大肠癌是大肠粘膜上皮和腺体发生的恶性肿瘤，据2009年世界卫生组织的报告，全球大肠癌的发病率处于恶性肿瘤的第四位，每年大约有639,000人因大肠癌而死亡。BORIS(brother of the regulator of imprinted sites)被认为是一个具有独特表观遗传作用、促进肿瘤生长的转录因子。正常大肠粘膜细胞癌变时存在表型的逐步变化，同时伴随基因的改变，特别是抑癌基因的失活，这主要归因于这些基因启动子甲基化。DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而抑制基因表达。BORIS可修饰某些基因5'末端非编码区的CpG岛[1],从而使得基因去甲基化而激活。例如，BORIS可通过去甲基化激活CTA基因的启动子从而启动MAGE-A及NYESO-1等CTA的表达[2]。以往的研究认为，正常情况下BORIS只局限的表达在男性睾丸组织的生殖细胞中，在其他组织不表达。但后来在很多恶性肿瘤组织中可检测到BORIS mRNA的高水平表达，在200多种可代表人类主要肿瘤类型的肿瘤细胞系中也都检测到BORIS mRNA的表达，如胃癌，乳腺癌，子宫内膜癌，前列腺癌等，但是BORIS在人大肠癌组织中的表达却缺乏相关研究，因此本实验将对此进行研究，旨在明确BORIS在大肠的表达及其与临床病理因素之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2012年1月至2012年11月湖南省人民医院普外科经手术切除的结、直肠癌标本组织60例设为实验组以及相匹配的距肿瘤大于5cm以上的手术切缘正常大肠组织标本40例 （均经术后病理证实）为对照组；同时收集患者同期相关临床资料，所有患者术前均未行放、化疗。以全国大肠癌病理研究统一规范及结直肠癌诊疗规范进行病理诊断、分级和分期。实验组中男性患者38例，女性患者22例，年龄介于28-83岁，中位年龄62.5岁，其中结肠癌43例，直肠癌17例。

1.2 方法

采用免疫组织化学SP法（链酶卵白素-过氧化酶法）按福州迈新公司试剂盒说明操作，阴性对照用PBS液代替，1抗作为空白对照.1抗BORIS的工作浓度均为1:50。

1.3 结果判定

腺体细胞胞浆出现棕黄色阳性颗粒为阳性细胞，随机观察10个高倍视野，每个视野计数100个腺体细胞，根据阳性细胞比率和染色强度综合评定。结果进行半定量分析：0～10%为0分；11%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；76%～100%为4分。显色度按细胞着色的深浅计分,①1分,弱；②2分,中等；③3分,强。两分相加，得分≤2为阴性：-；得分≥2为阳性：+。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理，率的比较采用χ2检验、χ2检验的校正公式，α= 0.05，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 BORIS在大肠癌组织和切缘正常大肠组织中的表达情况

在本项研究中,60例大肠癌组织和40例切缘正常大肠组织中BORIS的表达结果如图1所示。大肠癌组织中BORIS表达的阳性率为85%（51/ 60），切缘正常大肠组织中BORIS表达的阳性率为12.5%（5/40）。大肠癌组织中BORIS表达的阳性率比切缘正常大肠组织中高，差异具有统计学意义（χ2=，P＜0.005)。见表1。

表1 大肠癌组和切缘正常大肠粘膜组中BORIS表达情况

图1 正常大肠组织阴性对照和BORIS在正常大肠组织中的表达

2.2 BORIS表达与大肠癌临床病理因素的关系

由表2、图2可见，BORIS蛋白表达阳性率与肿瘤大小、浸润深度、Dukes分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度有关，差异具有统计学意义（P＜0.05)；与患者年龄、性别、肿瘤发生部位无关（P＞0.05)。

表2 BORIS表达与大肠癌临床病理因素的关系

图2 大肠癌组织阴性对照和BORIS在大肠癌组织中的表达

3 讨论

大肠癌主要包括结肠癌和直肠癌，在发达国家人群如欧洲、美国和日本的发病率高于非洲和亚洲。大肠癌是一个多因素、多阶段、多基因参与的复杂过程，大肠癌发病的病因是多种多样的，涉及了生活饮食方式、遗传因素、肥胖、缺乏锻炼、饮酒、吸烟、大肠腺瘤性息肉、大肠慢性炎症、亚硝胺类化合物、放射线损害等因素。大肠正常上皮演进至癌形成及癌的浸润和转移，有多种基因的参与，随着分子生物学技术的发展，对大肠癌分子遗传学模型进行了大量研究，将有助于阐明大肠癌发生机制，并可用于大肠癌的早期诊断、预后评价、治疗效果的评价和靶向治疗。近年来发现肿瘤/睾丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)作为肿瘤相关抗原的一类,在肿瘤学研究中越来越引起人们的关注。CTA一般特异性表达在男性正常睾丸组织的生殖细胞和多种不同组织类型的癌细胞中，而在其它正常组织不表达或低表达，并且在癌症患者中有抗原性免疫反应，对于肿瘤免疫靶向治疗可能具有重要意义。BORIS是CTA的的成员之一，它与哺乳动物的CTCF基因组一样，具有相同外显子编码的11个锌指结构域，但编码CTCF的氨基末端和羧基末端却有所不同[3]。因此，BORIS又称 CTCF样蛋白( CCCTCbinding factor-like protein,CTCFL)。据以往的研究认为，BORIS只存在于男性睾丸，在其他组织中不表达，它在雄性生殖细胞发育中与CTCF以交互排列的方式表达,与雄性生殖细胞发育过程中的甲基化标志重建有关。而越来越多的研究显示，由于BORIS在中央DNA结合区域的蛋白相关调节器具有广泛的同源性，在早期配子基因组和多种肿瘤细胞中可以检测到mRNA BORIS的高表达，但在分化的体细胞中不表达[4-7]。由于BORIS在恶性肿瘤的早期就开始表达，因此有可能作为肿瘤免疫治疗的重要分子[8]。

大肠癌有无淋巴结转移及转移程度是判断患者预后的重要指标，直接影响患者的生存期。本研究通过直接对大肠组织免疫组化染色发现，在大肠癌组织中BORIS蛋白的阳性表达率较切缘正常大肠粘膜阳性率明显升高，BORIS主要在细胞核中表达，胞浆也有部分表达。大肠癌组织中BORIS的表达与患者年龄、性别及肿瘤的部位、组织学类型无关，与肿瘤大小、浸润深度、Dukes分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度有关。在不同分化程度的大肠癌组织中，BORIS的表达是不同的。BORIS可能是具有较高敏感性的肠上皮特异性标志物，在大肠癌的发生过程中起着重要作用据此，我们推测BORIS可能作为大肠癌的早期诊断和预后判断的一种新的潜在的标记物。通过检测BORIS有助于鉴别良、恶性大肠肿瘤和指导临床治疗与判断患者的预后。

[1]Loukinov DI,PugachevaE,VatolinS,et al.BORIS,a novel male germ-line-specific protein associated with epigenetic reprogramming events,shares the same11-z inc-finger domain with CTCF,the in sulator protein involved in reading imprinting marks in the soma[J].P roc N at lAcad Sci USA,2002,99(8):6806-6811.

[2]Vatol in S,Abdullaev Z,Pack D,et al.Conditional expression of the CTCF-paralogous transcriptional factor BORIS in normal cells results in demethylation and derepression of MAGE-A1 and reactivation of other cancer-testis genes[J].Cancer Research,2005,65(17): 7751-7762.

[3]Klenov EM,Morse HCIII,Ohlsson R,et al.The novel BORIS +CTCF gene family is uniquely involved in the epigenetics of normal biology and cancer[J].Sem in Cancer Biol, 2002,12(9):399-414.

[4]Risinger JI,Chandramou li GV,M ax well GL,et al.Global expression analysis o f cancer-testis genes in uterine cancers reveals a high incidence o f BORIS expression[J].Clin Cancer Res,2007,13(6):1713-1719.

[5]D'Arcy V,Abdullaev ZK,Pore N,et al.The potential of BORIS detected in the leukocytes of breast cance r patients as an early markerof tumorigenesis [J].Clin Cancer Res,2006,12(20):5978-5986.

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[7]Pugacheva EM,SuzukiT,et al.The Structural Complexity of the Human BORIS Gene in Gametogenesis and Cancer.PLoS ONE,2010,5(11):e13872.

[8]JonesPL,Wolffe AP.Relationshipsbetween chromatin organization and DNA methylation in determining gene expression[J].Sem in Cancer Biol,1999,9(7):339-347.