醉椒素脂质体的制备及其理化性质考察

陈玉堂， 袁 曼， 朴军颜， 闫淑娟， 徐 霞

(郑州大学 药学院 河南郑州450001)

0 引言

醉椒素(kavain)是从卡瓦胡椒根中提取的活性成分，卡瓦胡椒是胡椒科多年生直立灌木类药用植物，产于南太平洋诸岛，野生或栽培，根和根茎入药，鲜叶亦可药用.该植物一直是这些岛国居民的生活用品，用作放松机体和情绪、恢复体力和减轻疼痛，近年来开始为欧美人所接受，并成为目前美国和德国最畅销的草药之一.1769年James Cook发现卡瓦胡椒根中含有Kavain methysticin，yangonin等内酯成分［1］.现代药理研究表明醉椒素具有镇静催眠、抗痉挛和局部麻醉的作用［2］.并且对前列腺癌细胞PC-3具有较好的杀伤作用［3］，但其生物半衰期较短，口服生物利用度低，大剂量长时间服用卡瓦制品可能导致肝细胞损伤、黄疽、肝硬化甚至肝功能衰竭等.故开发脂质体制剂具有深远意义.

脂质体属于靶向给药系统的一种新剂型.它可以将药物或者溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬，从而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中蓄积，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性［4］.本实验采用薄膜分散法制备了醉椒素脂质体，并考察了其体外释放，为后期体内的研究奠定基础.

1 仪器与材料

Nano-ZS型激光散射粒径分析仪(英国Malvern公司);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司);SHB-Ⅲ循环水室多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);BP211D型电子天平(德国赛多利斯有限公司);μV-2102C型紫外分光光度计(上海尤尼克仪器有限公司);Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Agilent紫外检测器(美国安捷伦公司).

天然大豆磷脂(LIPOID S-100，SPC)(上海东尚实业有限公司);S188泊洛沙姆(南京威尔化工有限公司);醉椒素(上海时代生物科技有限公司，纯度＞95%);甲醇为色谱纯;胆固醇、氯仿均为分析纯.

2 方法与结果

2.1 醉椒素脂质体的制备

采用薄膜超声法.称取处方量的大豆卵磷脂、胆固醇和醉椒素溶于12 mL氯仿中，水浴超声溶解，得脂质溶液.37℃恒温水浴减压旋转蒸发出有机溶剂，使磷脂等成膜材料在茄形瓶壁上形成均一类脂膜.称取泊洛沙姆188少量溶于5 mL葡萄糖溶液中，即为水相;将水相加入茄形瓶后水合90 min，进行冰浴探超，300 W探超3 s，间歇6 s，30次，即得醉椒素脂质体.

2.2 粒径和粒度分布、表面电位研究

取适量醉椒素脂质体溶液，稀释50倍，注入到Nano-ZS纳米粒度和Zeta电位分析仪的石英检测池，分别测定粒径和Zeta电位.结果显示粒径呈单峰分布，范围在100～200 nm，均值为(161±5)nm，表面电位为(2.37±0.2)mV.

2.3 醉椒素脂质体包封率的测定

2.3.1 标准储备溶液的配置 取醉椒素对照品约5.0 mg，精密测定，置于50 mL容量瓶中，用甲醇-水(70∶30)溶解并稀释至刻度，摇匀，100 μg/mL作为标准储备液.

2.3.2 脂质体破乳方法 分别取空白脂质体、醉椒素脂质体各0.5 mL，分别加甲醇4.5 mL，在旋涡混合器上充分振荡混匀5 min，取1.0 mL置于1.5 mL离心管中，6 000 r/min离心5 min，取上清液20 μL进样分析.

2.3.3 色谱条件 色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:甲醇 -水(70∶30)，柱温25℃，检测波长为246 nm.体积流量为1 mL/min，进样量为20 μL.

2.3.4 专属性实验 取“2.3.1”项下醉椒素标准贮备液及“2.3.2”项下空白脂质体破膜溶液、空白脂质体破膜溶液+醉椒素贮备液各50 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱.在该色谱条件下，空白脂质体不影响醉椒素的测定且峰形稳定，保留时间为5.45 min，脂质体辅料和破膜溶液不干扰醉椒素的测定，详见图1.

图1 高效液相色谱Fig．1 HPLC

2.3.5 标准曲线的制备 精密量取醉椒素标准储备液适量，分别用甲醇稀释制成浓度为100.0，80.0，60.0，40.0，20.0，10.0，5.0，1.0 μg/mL 的醉椒素对照品溶液，于上述色谱条件下测定，进样20 μL，以醉椒素峰面积与浓度作线性回归，得回归方程 y=137．26x-58．805(R=0.999 7)，结果表明醉椒素1.0～100.0 μg/mL线性关系良好.

2.3.6 回收率实验 用空白脂质体和醉椒素标准储备液，配置浓度分别为1.00 μg/mL，20.00 μg/mL，60.00 μg/mL的样品各3份，按“2.3.2”项下破膜方法处理，进行分析，以测得浓度除以理论配置浓度计算回收率.高、中、低浓度的回收率均符合样品分析的要求.回收率实验结果详见表1.

表1 醉椒素回收率试验结果(n=3)Tab．1 Recovery of docetaxel(n=3)

2.3.7 精密度试验 取“2.3.6”项下高、中、低3个浓度的溶液，各5份，以1 d内每个浓度连续测定5次醉椒素的浓度，计算日内精密度;以连续3 d测得醉椒素浓度计算日间精密度.精密度实验结果详见表2.

2.3.8 醉椒素脂质体包封率的测定 按照”2.1”项下的方法制备脂质体样品3份，精密吸取上述醉椒素脂质体1.0 mL，加超纯水稀释至5.0 mL量瓶中，将上述脂质体混悬液置于超速冷冻离心机中，12 000 rpm，4℃离心30 min，离心2次分离脂质体和游离药物，取1 mL上清溶液，HPLC法测定醉椒素的浓度(C游).

表2 醉椒素精密度实验结果Tab．2 Inter-day and intra-day precision of kavain

精密吸取醉椒素脂质体1.0 mL，用甲醇稀释至适量倍数，HPLC法测定醉椒素的浓度(C总).

C总为脂质体中混悬液中药物的总质量浓度，C游为脂质体游离药物的质量浓度.结果，所制备脂质体样品的平均包封率为(77.09±2.47)%，该法重现性较好.

2.3.9 稳定性考察 将醉椒素脂质体按5 mL分装在西林瓶中，于25℃和4℃冰箱中分别放置保存.分别于0 d，7 d，14 d观察其外观性状并检查平均粒径、Zeta电位及包封率3个参数，每次取3小瓶检测以考察脂质体的稳定性.结果，所制备制剂于25℃，14 d内，均为淡蓝色乳光的均匀混悬液.样品稳定性考察结果详见表3.

表3 样品稳定性考察结果(n=3)Tab．3 Stability of samples(n=3)

3 讨论

薄膜分散超声法制备脂质体的常用方法，该法制备的醉椒素脂质体能增加脂质体膜的稳定性和均一性，使醉椒素更好的包裹在脂质体中.

薄膜分散超声法制备的脂质体为多层脂质体［5］，如果不经过探超处理，脂质体粒径一般比较大，并且波动也比较大.脂质体粒径的大小决定其靶向的位置，并且也影响其在体内的稳定性，大的脂质体易被网状内皮系统吞噬，在体内的半衰期较短，而肝、脾可以减少对小于200 nm的脂质体的摄取.试验中采用探超法，得到粒径大多在135～200 nm内，且分布均匀.

本实验采用超高速离心法测定包封率，由于分子密度不同，含药脂质体和游离醉椒素在转速达到12 000 rpm时作用30 min，就会分为上下两层.该方法简单易行，便于操作.

在考察脂质体的初期稳定性，主要以外观状态、平均粒径、Zeta电位以及包封率作为参考指标，25℃和4℃密封放置14 d，以上指标无显著性改变，现有处方、工艺条件所制备的脂质体制剂有良好的稳定性.

［1］ 杨卫东，张金萍，王敬文.卡瓦胡椒引种栽培及药用价值［J］.浙江农业科学，2005，5(5):343-345.

［2］ 王厄舟，潘胜利，张淑芳.卡瓦胡椒活性成分及药理活性研究进展［J］.中草药，2001，32(9):855-858.

［3］ Li Xuesen，Liu Zhongbo，Xu Xia，et al.Kava components down-regulate expression of AR and AR splice variants and reduce growth in patient-derived prostate cancer Xenografts in mice［J］.PLoS One，2012，7(2):312-313.

［4］ 钱思源.申报细胞毒类抗肿瘤药物脂质体的立题考虑和临床研究方法［J］.中国临床药理学杂志，2006，22(6):472-474.

［5］ 高申.现代药物新剂型新技术［M］.北京:人民军医出版社，2003.