丝氨酰组氨酰赖氨酸三肽的合成*

徐常龙，曹小华，严 平，柳闽生，张爱东，张 岩

(1.九江学院生命科学学院，江西九江 332000;2.南京晓庄学院化学系，江苏 南京 210017;3.华中师范大学农药与化学生物学教育部重点实验室，湖北武汉 430079)

含His-Lys序列的肽是一种具有不同生物功能的内源性多肽，可由多种组织细胞表达和分泌，发挥多种生物学功能［1～4］，其化学合成是研究热点［5～7］。研究发现丝氨酰组氨酰赖氨酸三肽［ZSer-His(Trt)-Lys-Z-OBzl，1］具有细胞生长因子的功能［8］，并且由于其中丝氨酸具有羟基侧链，在一定条件下可与糖或卤代糖形成O-糖肽链［9］。糖肽是糖蛋白活性中心的结构区域，在细胞免疫学和医学上可用于抗原与受体的识别作用，在生物学上可用于对细胞间相互作用和遗传学研究［10］，因此，1的合成有重要的生物学意义。

本文利用液相合成法，L-丝氨酸(L-Ser)，L-组氨酸(L-His)和L-赖氨酸(L-Lys)经活化后缩合合成了1(Scheme 1)，其结构经1H NMR，IR和GC-MS确证。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

XT4A型显微熔点仪;Mer-curyPlus-400型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标);Nicolet 470型红外光谱仪;Trace MS型质谱仪。

3［5］，A-B［6，11］按文献方法合成;L-Ser，L-His，L-赖氨酸盐，苄氧甲酰氯，N-羟基琥珀酰亚胺，N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，化学纯，上海吉尔生化公司;其余所用试剂均为分析纯，其中Et3N使用前重蒸，EtOAc和MeOH经无水处理。

Scheme 1

1.2 合成

(1)Z-Ser-OH(A)的合成

在反应瓶中加入L-Ser 6.0 g(57 mmol)和2 mol·L-1NaOH溶液33 mL，冰浴冷却，搅拌下缓慢滴加苄氧酰氯12.8 mL(90 mmol)，滴毕，用2 mol·L-1NaOH 溶液(约 45 mL)调至 pH 8.0，反应8 h。撤去冰浴，反应过夜。用乙醚(50 mL)洗涤，冰浴下用浓盐酸(约6 mL)调至pH 3.0(出现白色沉淀)，静置(冰箱)3 h;过滤，滤饼用水(4×20 mL)洗涤，真空干燥过夜得白色固体A 8.5 g，产率62.2%，m.p.99 ℃ ～ 101 ℃;1H NMR δ:3.84～3.87(m，2H，CH2)，4.27(m，1H，CH)，5.10～5.14(m，2H，CH2)，7.28～7.38(m，5H，PhH);IR ν:3 424，3 338，3 329，3 211，3 030，1 746，1 692，1 600，1 535，1 401，911，750，697 cm-1。

(2)H-His(Trt)-OH(2)的合成

在反应瓶中依次加入 L-His 3.0 g(19.3 mmol)和 CH2Cl215 mL，搅拌下加入 Me2SiCl22.33 mL(19.3 mmol)，于室温反应 5 h;加入 Et3N 2.68 mL(19.3 mmol)，反应 15 min;依次加入 Et3N 1.39 mL(10 mmol)和三苯基氯甲烷(Trt-Cl)5.38 g(4.2 mmol)的 CH2Cl2(10 mL)溶液，反应 2 h。加入过量无水MeOH，旋蒸脱溶，加水10 mL，用Et3N 调至 pH 8.0 ～8.5，加入 CHCl320 mL，过滤，滤液依次用水(20 mL)和乙醚(20 mL)洗涤，用混合溶剂［V(THF)∶V(H2O)=1 ∶1］重结晶，真空干燥48 h 得白色固体2 4.2 g，产率54.%，m.p.218 ℃ ～ 221 ℃;1H NMR δ:2.92 ～ 3.16(m，2H，CH2)，3.79 ～3.82(m，1H，CH)，6.85(s，1H)，7.12 ～7.41(m，5H，PhH);IR ν:3 414，3 050，2 966，1 629，1 597，1 491，1 246，1 230，753，701 cm-1。

(3)H-His(Trt)-OMe(B)的合成

在反应瓶中加入甲醇8 mL，冰盐浴冷却至-10℃，搅拌下缓慢滴加SOCl21 mL，滴毕，加入2 4.0 g，于20℃反应2 h;回流反应(70℃ ～80℃)30 min(组氨酸完全溶解)。旋蒸脱溶，加无水乙醚30 mL～40 mL(大量晶体析出)，于冰箱中静置1 h～2 h，抽滤，滤饼用无水乙醚洗涤，真空干燥得白色固体B 3.05 g，产率40.3%，m.p.118℃ ～ 121 ℃;1H NMR δ:3.10(s，3H，CH3)，3.15～3.30(m，2H，CH2)，4.13(m，1H，CH)，6.96(s，1H)，7.15 ～7.76(m，5H，PhH);IR ν:2 937，2 928，1 631，1 182，1 057 cm-1。

(4)H-Lys(Z)-OH(4)的合成

在反应瓶中依次加入盐酸赖氨酸10 g(56 mmol)的水(75 mL)溶液，碱式碳酸铜 12.7 g，搅拌下回流反应4 h。加热水(60℃ ～70℃)50 mL，过滤，滤液冷却至0℃，用固体Na2CO3调至pH 9，恒温(0℃)下滴加苄氧甲酰氯58 mL(约1 h，用固体 Na2CO3控制 pH≈9)，于室温反应12 h;过滤得蓝色固体［12］，加水 200 mL，加入硫代乙酰胺8.42 g(112 mmol)，于50℃反应3 h。用2 mol·L-1盐酸调至 pH 2，煮沸5 min，过滤(除去CuS沉淀［13］)，滤液浓缩至 60 mL(析出白色沉淀)，过滤，真空干燥48 h得白色固体4 2.3 g，产率 20.1%，m.p.246 ℃ ～ 248 ℃;1H NMR δ:1.42 ～1.53(m，6H，CH2)，1.78 ～1.80(m，3H，CH2N)，3.12(m，2H，PhCH2)，3.31～3.51(m，2H，NH2)，7.28 ～ 7.38(m，5H，PhH);IR ν:3 345，3 338，3 319，3 054，3 034，1 582，1 513，1 419，940，1 692，747，697 cm-1。

(5)H-Lys-(Z)-OBzl(C)的合成

在反应瓶中加入4 2.0 g(7.1mmol)和AcOEt 45 mL，搅拌使其完全溶解;依次加入Et3N 1.0 mL(7.1mmol)和 PhCH2Br 0.8 mL(35.7 mmol)，回流反应6 h。抽滤［14］，滤饼用乙酸乙酯洗涤，合并滤液与洗液，依次用0.5 mol·L-1碳酸氢钾溶液(2×20 mL)、饱和氯化钠溶液(2×20 mL)和1.17 mol·L-1氯化钠溶液(50 mL)洗涤至中性，用无水Na2SO4干燥，旋蒸脱溶得油状液体C 2.1 g，产率 67.8%。

(6)1的合成

在反应瓶中依次加入A-B 9.74 g(15 mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)1.78 g(15.5 mmol)和四氢呋喃21 mL，搅拌使其完全溶解;冰浴冷却下滴加DCC(3.18 g)的 THF(6 mL)溶液，滴毕，反应6 h。自然升至室温，静置过夜，过滤(除去N，N-二环已基脲)得溶液(E)备用。

在反应瓶中加入C 1.82 g(4.5mmol)和THF 10 mL，搅拌使其完全溶解;加入E，冰浴冷却下反应2 d。旋蒸脱溶得黄色黏稠状物，加乙酸乙酯20 mL，分别用饱和 NaHCO3溶液(3×20 mL)、柠檬酸溶液(3×20 mL)和饱和NaCl溶液(3×20 mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，旋蒸脱溶后经硅胶柱层析［洗脱剂:V(CH3Cl3)∶V(CH3OH)=5 ∶1］纯化得淡黄色固体 1 1.3 g，产率 42.1%;1H NMR δ:3.38 ～3.48(m，8H，CH2)，3.85(m，1H，NH)，3.12(m，2H，PhCH2)，7.55 ～8.92(m，10H，PhH);EI-MSm/z:898(M+)，551，243，91。

2 结果与讨论

2.1 合成

肽的化学合成法包括液相合成和固相合成法。两者各有优缺点，对于较小的肽，液相反应比固相反应较方便，纯化较容易。在肽的化学合成中，主要是酰胺键的形成和侧链基团的保护。肽的液相合成法发展至今，运用较为广泛的主要有混合酸酐法［16］、活化酯法［17］和缩合剂法［18］。缩合剂法中最为普遍使用的是二环已基碳二亚胺(DCCI)法，反应中氨基的活化通常加入有机碱如三乙胺、N-甲基吗啉等，能抑制副反应且提高收率，本文采用此种方法。

在1的合成中，由于其中的氨基酸均为三官能团的氨基酸，给合成带来一定困难，因此选择合适的保护基显得极为重要，也是能否合成较纯产物肽的关键。本文采用HOSu-DCCI法合成1，用N-甲基吗林调节体系pH至9。在制备保护氨基酸时，考虑到1含有L-Ser，其侧链羟基可和溴代葡萄糖反应形成糖肽［19］，三肽上所有的保护基在糖肽形成后才脱除，由于O-糖所含肽键在酸性和碱性条件下均会断裂，因此氨基酸的侧链氨基和羧基的保护基，必须在温和条件下容易脱去，且在脱保护反应中对肽链的酰氨键和糖肽中O-糖肽键的影响很小。因此本文采用苄酯保护L-Lys的羧基，苄氧甲酰氯保护L-Ser的氨基和L-LysE位上的氨基，而苄基和苄氧甲酰基可在在中性条件用催化氢化法除去［7］，且氢化还原彻底，同时除掉了两种保护基团，简化反应步骤。

在甲酯B的合成中，采用SOCl2酰化L-His的羧基，会产生一定的副反应，Trt基在酸性条件下会脱除，因此控制SOCl2的加入量十分重要。本文对文献［20］方法进行了改进，减少 SOCl2用量，延长反应时间，并在反应中升温回流之前，加入NaHCO3调节体系pH至中性，制得咪唑基上的氨基保护的组氨酸甲酯。

本文合成了具有细胞生长因子功能的丝氨酰组氨酰赖氨酸三肽，以其为原料可合成具有重要生物功能的分子糖肽。为研究其对细胞生长的影响状况奠定了基础，提供了其在医学及免疫学中应用的可能。

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