厚朴提取物对大鼠CYP2D6亚型酶的影响

于卫江，张 斌，张文周

(郑州大学附属肿瘤医院河南省肿瘤医院药学部，河南郑州，450008)

厚朴为木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹叶厚朴 Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮，性苦、辛，温，归脾、胃、肺、大肠经，主治燥湿消痰，下气除满，用于湿滞伤中，脘痞吐泻，食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳［1］。厚朴提取物主要成分是厚朴酚与和厚朴酚，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抑制溃疡、抗炎、镇痛及中枢稳定等多种药理作用［2］。经体外筛选试验［3］显示，厚朴提取物能够抑制CYP2D6亚型酶的活性。本实验通过高效液相色谱法(HPLC)测定大鼠尿液和肝微粒体重组系统中CYP2D6的探针药物右美沙芬(DM)的代谢率，皆在探讨厚朴提取物在体内对CYP2D6亚型酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物:成年雄性Wistar大鼠16只，体质量(200±20)g。

药品与试剂:DM、去甲右美沙芬(DX)、β－葡萄糖醛酸酶、己烷磺酸钠购于Sigma公司;厚朴提取物购自宁波市中药制药厂;内标丁丙诺啡购于中国药品生物制品检定所。

主要仪器:Waters Empower 2010色谱管理系统(717自动进样器，616泵，470荧光检测器);高速冷冻离心机(美国Beckman公司)，SHZ－82水浴恒温振荡器(江苏金坛市科兴仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 动物实验:将大鼠随机分成对照组和实验组，每组8只，2组大鼠分别给予生理盐水1 mL和1.0 g/kg的厚朴提取物，连续1周，第8天时给予2组大鼠6 mg/kg的DM，并留置代谢笼收集8 h尿液后，大鼠断头处死(处死前禁食24 h)。取尿样和肝脏，分别置 －20℃和 －80℃冰箱保存。

1.2.2 DX与DM浓度的测定:用HPLC测定尿样中DX与DM浓度，用二者之间的比率(DX/DM)，即DM代谢率表示CYP2D6亚型酶的活性。通过比较实验组和对照组之间DM代谢率，确定厚朴提取物对CYP2D6亚型酶活性的影响。

1.2.3 尿样处理:取1 mL尿样，加入2 mmol/L内标溶液丁丙诺非50 μL，pH 5.0醋酸钠缓冲液1 mL，混旋0.5 min，置于37℃水浴水解14 h，加入3 mL提取液正己烷∶正丁醇(9∶1)，3 mol/L氢氧化钠1 mL，混旋5 min，3 000×g离心5 min。取出上层有机相2 mL置具塞离心管中，加入0.01 mol/L 盐酸200 μL 混旋3 min，3 000×g离心5 min，小心取下层水相20 μL进样分析。

1.2.4 肝微粒体制备:肝组织经剪碎、漂洗、吸干后称重，按1∶4(V∶V)加入匀浆缓冲液(50mmol/L Tris，质量浓度为 11.5 g/L KCl，HCl调 pH 至7.4)，冰浴;用玻璃匀浆器制成肝匀浆，4℃下9 000×g离心20 min，取上清液转移至超速离心管内4℃下100 000×g离心60 min;沉淀即为肝微粒体，重悬于0.25 mol/L蔗糖溶液中，分装，置－80℃冰箱内保存备用。

1.2.5 肝微粒体体外温孵系统:温孵反应体系中肝微粒体蛋白浓度1 mg/mL，NADP+1 mol/L，异柠檬酸钠2 0 0 mmol/L，异枸橼酸脱氢酶10 U/mL，MgCl210 mmol/L，探针药物右美沙芬0.3 mmol/L，以0.1 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)定容至 500 μL，加入 NADP+开始反应。37℃水浴中孵化40 min，加入50 μL冰冷的三氯醋酸终止反应。

1.2.6 肝微粒体样品处理:于500 μL温孵反应液中加入50 μL内标溶液丁丙诺非(2 mmol/L)，3 mmol/L 氢氧化钠 100 μL，2.0 mL 正己烷∶正丁醇(9∶1，V∶V)，混悬振荡5min提取，3000×g离心5 min;取上层有机相2 mL置具塞离心管中 ，加 入0.0 1 mmol/L盐 酸1 5 0 μL混 旋3 min，3 000×g离心5 min;取下层水相20 μL进样分析。

1.2.7 同浓度厚朴提取物和西咪替丁抑制力比较:取实验组大鼠肝微粒体，根据加入药品不同将其分为对照组、厚朴提取物组和西咪替丁组。对照组温孵反应体系同上述，后2组在其温孵反应体系中分别加入厚朴提取物(0.1 mg/mL)和西咪替丁(0.1 mg/mL)，孵化条件和色谱条件同上，测定3组大鼠肝微粒体中DX与DM浓度，比较3组DM代谢率。

1.2.8 色谱条件［4］:尿样色谱条件为色谱柱:Hypersil－C6H5柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，大连依利特公司)，室温下测定，EX=280 nm，EM=310 nm。流动相:0.01 mol/L磷酸二氢钾:0.01 mol/L己烷磺酸钠∶乙腈∶甲醇(33∶33∶80∶54，V∶V)，pH4.0，流速 1.0 mL/min。肝微粒体色谱条件流动相变为0.01 mol/L磷酸二氢钾:0.01 mol/L己烷磺酸钠:乙腈:甲醇(33∶33∶100∶94，V∶V)，其余同尿样。

2 结果

2.1 2组大鼠尿样中DM代谢率比较

实验组大鼠尿样中DM代谢率为55.04±25.90，明显低于对照组(160.75 ±31.06)，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.2 2组大鼠体外肝微粒体中DM代谢率比较

实验组大鼠体外肝微粒体中DM代谢率为0.014 ±0.007，明显低于对照组(0.042 ±0.014)，差异有统计学意义(P ＜0.01)。

2.3 3组肝微粒体中DM代谢率比较

厚朴提取物组肝微粒体中DM代谢率为0.010 ±0.003，显著低于西咪替丁组(0.043 ±0.015)和对照组(0.069 ±0.020)，差异有统计学意义(P＜0.05)，而西咪替丁组和对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

细胞色素P450是一个复杂的酶系统，由其参与的生物转化是药物代谢的重要环节，同时许多药物又对细胞色素P450酶系的活性有抑制和诱导作用，从而导致临床药物的相互作用［4］。中药厚朴药理作用广泛，临床应用较多，采用厚朴配方的中西成药多达200余种，常用制剂包括藿香正气水、麻仁丸、香砂养胃丸等［5］。很多OTC药品含有厚朴成分，因此研究厚朴对细胞色素P450的影响，对于促进临床合理用药尤其是中西药物合并使用的安全性具有一定指导意义。

本研究HPLC检测法在黄丽军等［6］的实验研究基础上完成，在体外实验的基础上，进一步通过大鼠体内实验分析探讨了厚朴提取物对CYP2D6亚型酶的影响，结果表明实验组大鼠尿样及体外肝微粒体种DM代谢率均明显低于对照组，说明长期应用厚朴提取物可有效抑制CYP2D6 亚型酶的活性［7－11］。因此在使用羟考酮、异丙嗪、曲马朵等经CYP2D6亚型酶代谢药物，且同时应用含厚朴制剂时，应注意因代谢减慢而出现的不良反应。

具有抑制CYP2D6作用的药物包括奎尼丁、特比奈芬、西咪替丁、美沙酮、利托那韦、咪康唑和吴茱萸次碱等［12－17］，而本研究选择了一种经典抑制剂西咪替丁，其在体外可抑制厚朴提取物诱导的大鼠肝微粒体重组系统DM的代谢。结果表明，厚朴提取物组肝微粒体中DM代谢率显著低于西咪替丁组和对照组，说明在抑制CYP2D6亚型酶的活性方面，厚朴提取物的能力明显优于西咪替丁。

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