Toll样受体9与系统性红斑狼疮患者的临床特点相关性

史晓飞，王　可，樊琳琳，马　新，付建斌

(河南科技大学第一附属医院风湿免疫科，洛阳 471003)

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫中重要的病原体识别受体，通过识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)诱导免疫效应分子表达，激活多种前炎性因子参与抗感染过程。新近研究认为，TLRs与其相应的特异性配体(包括内源和外源性配体)结合，参与并调控特异性免疫应答过程，在天然免疫和特异性免疫之间架起桥梁。因此，TLRs在自身免疫性疾病中的作用逐渐受到重视。家族成员Toll样受体9(toll-like receptor 9，TLR9)能够特异性识别内源或外源DNA中非甲基化的CpG-DNA基序，启动炎性应答信号通路，诱导自身抗体、炎性分子产生，引发炎性反应和免疫效应，在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的发病过程中发挥一定作用，近2年也成为研究热点[1]。SLE是以自身反应性T、B细胞异常活化、产生致病性自身抗体和免疫复合物为主要特征的一种慢性炎性自身免疫病，病情复杂且诊治困难，本文旨在通过了解TLR9表达与SLE临床特点的相关性，以期为TLR9用于疾病临床诊断和病情监测提供理论依据。

对象和方法

对象

河南科技大学第一附属医院2009年12月至2011年3月门诊和住院SLE患者48例，诊断符合1987年美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)诊断标准，并根据SLE疾病活动指数(SLE disease activity index，SLEDAI)评分标准，分为SLE活动期组(≥10分)和SLE非活动期组(<10分)。

疾病对照组36例，包括类风湿关节炎15例，干燥综合征12例，系统性硬化症4例，肌炎皮肌炎5例。诊断均符合国际诊断标准，并排除合并感染、肿瘤等患者。

健康对照组为25名来自体检中心的健康体检者，抽血前1个月内无感染史。

方法

细胞内流式细胞术检测外周血CD19+B淋巴细胞TLR9表达：(1)每例标本取3支流式上样管分别标记A、B、C，各加入100 μl抗凝全血；A、B管加入PE标记的鼠抗人CD19单克隆抗体(美国BD公司)，C管为空白对照，混匀、孵育。(2)加入红细胞裂解液，混匀、孵育，离心、弃上清，PBS清洗。(3)加入预冷(4℃)固定液(Fix&Perm1，美国eBioscience公司)，孵育，PBS清洗。(4)加入破膜剂(Fix&Perm2)，轻微震荡，孵育，PBS清洗。(5)A管加鼠抗人TLR9单克隆抗体(浓度5μgml，美国ALEXIS公司)，B管加入Mouse IgG1同型对照(美国ALEXIS公司)，混匀、孵育；C管加入0.5 ml PBS液重悬细胞，待测；A、B管PBS清洗，加羊抗鼠FITC荧光标记Ⅱ抗(美国BD公司)，混匀、孵育；PBS清洗，加入0.5 ml PBS液重悬细胞，与C管同上机检测分析。(6)应用流式细胞仪FASCan进行检测，利用前向散射光和侧向散射光以B淋巴细胞设门，对PE标记的CD19细胞中结合FITC标记的TLR9细胞进行检测，测定每样本门内20 000个细胞；检测结果用Cell Quest软件进行分析，记录CD19+细胞TLR9阳性细胞表达率。

血、尿常规、24 h尿蛋白定量、补体C3、红细胞沉降率、抗双链DNA抗体滴度测定等实验室资料采集按照我院常规方法测定。根据患者抽血前10 d内出现的临床症状和实验室检查结果，对SLE患者疾病活动情况以SLEDAI评分标准量化评分。

统计学处理

结　　果

一般情况

SLE活动期组27例，女25例，男2例，年龄为16～50岁，平均(30.2±8.9)岁。SLE非活动期组21例，女19例，男2例，年龄为20～53岁，平均(32.1±9.6)岁。SLE活动期组初发者15例，未使用糖皮质激素及免疫抑制剂治疗；复发者12例，抽血前泼尼松用量≤30 mgd，用药时间≤1个月。

疾病对照组36例，女30例，男6例，年龄为21～58岁，平均(34.1±8.5)岁。健康对照组25名，年龄为19～55岁，平均(29.4±7.9)岁。

CD19+B淋巴细胞TLR9表达

SLE活动期组外周血CD19+B细胞TLR9表达率高于非活动期组、疾病对照组及健康对照组(均P<0.01)。SLE非活动期组和疾病对照组CD19+B细胞TLR9表达率虽高于健康对照组，但差异无统计学意义(均P>0.05)。SLE非活动期组与疾病对照组CD19+B细胞TLR9表达率相似，差异无统计学差异(P>0.05)(表1)。

糖皮质激素对SLE患者CD19+B细胞TLR9表达率的影响

SLE活动期组中已用糖皮质激素治疗者外周血CD19+B细胞较未用药者下降(P<0.05)，而应用中小剂量糖皮质激素对TLR9在CD19+B细胞的表达无显著差异(P>0.05)(表2)。

CD19+B淋巴细胞TLR9表达与临床指标的相关性

SLE患者外周血CD19+B细胞内TLR9表达率与SLEDAI评分(r=0.763)、抗双链DNA抗体滴度(r=0.781)、红细胞沉降率(r=0.712)呈正相关(均P<0.01)；与24 h尿蛋白(r=0.186)及血清补体C3水平无明显相关(r=-0.326)(均P>0.05)。

表1外周血CD19+B细胞TLR9表达率

组　别例数CD19+B细胞TLR9表达率(%)SLE活动期组2754 18±17 97∗SLE非活动期组2132 97±9 85疾病对照组3630 88±9 12健康对照组2529 75±7 49

SLE：系统性红斑狼疮；TLR9：Toll样受体9；*与SLE非活动期组、疾病对照组、健康对照组比较，均P<0.01

表2SLE活动期患者应用糖皮质激素对CD19+B细胞TLR9表达率的影响

SLE活动组例数CD19+B细胞CD19+B细胞TLR9表达率未用糖皮质激素157 72±4 3259 78±20 84已用糖皮质激素124 01±3 7946 98±14 22t—2 341 81P—0 0280 082

SLE：系统性红斑狼疮；TLR9：Toll样受体9

讨　　论

迄今为止已发现10余种TLRs家族成员及其特异的TLR配体，不同成员在RA、干燥综合征、硬皮病等自身免疫病中得到不同关注。其中TLR9因识别内源或外源非甲基化CpG-DNA序列启动炎性应答信号通路、激活转录因子NF-κB、AP-1最终导致自身反应性T、B细胞活化，并诱导自身抗体和炎性分子产生，在SLE中的作用也受到越来越多的重视。

新近观点提出，B细胞可以不依赖T细胞直接由免疫复合物(immune complex，IC)通过TLRs途径激活参与自身免疫疾病的发病过程[2]，因此推测TLR9可能参与了SLE的发病过程。Leadbetter等[3]发现从MRL(lprlpr)狼疮鼠模型中分离出来的B细胞经包含CpG-DNA的IgG型IC刺激后能够产生大量自身抗体，而这一过程需要B细胞抗原受体和细胞内TLR9的协同作用。这一机制也能够解释Anders等[4]在MRL(lprlpr)狼疮鼠活体实验中应用细菌CpG-DNA处理后，可以导致狼疮鼠体内产生大量DNA自身抗体的现象。越来越多的资料显示，TLR9的衔接作用可能是SLE中B细胞活化及自身抗体产生的新的潜在机制[5]。

本实验利用细胞内流式细胞技术检测了TLR9在SLE患者、非SLE的结缔组织病患者及健康人外周血CD19+B淋巴细胞的表达水平，并探讨SLE患者疾病活动状态下外周血B细胞TLR9表达率情况。结果显示，SLE病情活动期TLR9表达显著升高，提示B淋巴细胞内TLR9的激活与SLE及临床病情活动存在一定联系。根据以往研究推测，SLE患者机体的免疫和炎性反应都存在明显异常，尤其是在病情活动期，体内出现高滴度自身抗体和大量免疫复合物[6]，从而提供更多促使TLR9途径激活的CpG-DNA配体，并通过前述机制进一步促进细胞因子产生与免疫细胞(包括自身反应B细胞)分化成熟，分泌自身抗体和形成IC。因此，TLR9表达随着疾病活动度增高而上调，且其表达增高也反映出B细胞处于高度活化状态。同时，这一机制也能够解释外源性感染容易诱发SLE活动的现象[7]，可能与细菌或病毒DNA侵入激活TLR9途径有关。目前国内外对于外周血B细胞TLR9表达情况尚存在争议，Kiyoshi等[8]利用流式细胞技术发现B细胞TLR9在SLE患者表达上调，结果与本研究相似。李守新等[9]检测外周血单个核细胞TLR9 mRNA水平发现，SLE患者较健康人表达降低，但这是基于TLR9转录水平的检测，不等同于TLR9在蛋白水平的表达情况。

SLEDAI评分及抗双链DNA抗体滴度等都是SLE疾病活动性评定的常用指标，对判断疾病预后及临床治疗都具有较好的指导作用。本实验结果显示，TLR9的表达与两者均具有正相关性，再次证实TLR9表达与SLE疾病活动存在一定联系；而其与补体C3水平无明显相关性，可能是TLR9不影响补体系统激活途径或者与样本量有关。此外，本研究发现，SLE患者应用小剂量糖皮质激素对外周血B细胞TLR9表达无明显影响，其原因尚不清楚。虽然糖皮质激素具有较强的抗炎和免疫抑制作用，且能够通过抑制NF-κB所引起的一系列免疫和炎性反应而发挥作用，但其作用机制广泛且复杂，同时这些作用也随剂量不同而异[10-11]。因此，是否由于剂量不足出现此现象，或者作为阻断TLR9下游信号方式并不影响TLR9本身的表达，这些都还有待进一步研究观察。

综上所述，TLR9介导的信号转导途径参与SLE的发生发展过程，可能与疾病活动、器官功能损害等临床特点存在一定相关性，因此可以通过外周B细胞TLR9的表达情况作为判断SLE患者疾病活动性及临床预后的指标之一。

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