GAD基因修饰神经干细胞在创伤性颅脑损伤大鼠中的作用

艾玲玲 谭晓东 杨露露

GAD基因修饰神经干细胞在创伤性颅脑损伤大鼠中的作用

艾玲玲 谭晓东 杨露露

目的 探讨移植谷氨酸脱羧酶（GAD）基因修饰的神经干细胞（Neural Stem Cells，NSCs）在创伤性颅脑损伤（TBI）大鼠中的作用。 方法 将40只雄性SD大鼠随机分成4组，每组10只。利用电穿孔转染大鼠NSCs，通过脑立体定向仪分别将GAD转基因NSCs（GAD+NSCs组）、NSCs（NSCs组）、磷酸盐缓冲液（PBS，PBS组）移植到TBI大鼠局部损伤灶附近，通过TUNEL法检测NSCs的凋亡情况，对照组大鼠不做处理，并进行神经损坏严重程度评分（neurological severity score，NSS）对移植后大鼠的神经系统行为和运动功能进行评估。结果 NSS结果显示GAD+NSCs组和NSCs组在第10、20、30天神经功能评分均低于PBS组（P＜0.05）；GAD+NSCs组在第10和20天神经功能评分低于NSCs组（P＜0.05）；在转基因NSCs移植7d后神经细胞凋亡数明显最少。 结论 转基因NSCs移植后合成GDA能够促进TBI大鼠神经功能的恢复。

GDA 神经干细胞 创伤性颅脑损伤

创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）后，损伤中心区域的神经细胞由于暴力撞击，部分细胞当即坏死，损伤区域周围残存的神经细胞因缺血、兴奋性神经递质释放、炎症反应等而发生凋亡[1]。因此，通过补偿死亡的神经细胞和挽救濒临死亡的神经细胞来修复神经损伤是TBI的研究热点。相关研究表明，将神经干细胞（neural stem cells,NSCs）植入神经系统疾病的动物模型中可促进实验动物的神经功能部分恢复[2]。近年来研究发现颅脑损伤后伴有保护抑制性神经递质伽马氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）的释放，从而可以保护大脑功能在原发性打击后，突触间隙及细胞外液谷氨酸浓度急速升高而造成的免遭继发性颅脑损伤（secondary brain injury，SBI）的损害[3]。本研究首次通过观察GAD基因修饰的NSCs移植到TBI模型的受损脑皮层后，大鼠神经功能及细胞凋亡的改变，为TBI的治疗寻求新思路。

1 材料和方法

1.1 动物与分组 选取健康雄性SD大鼠40只，体重250g左右，由浙江大学医学院动物实验中心提供。随机分成对照组、磷酸盐缓冲液（PBS）组、NSCs组、GAD+ NSCs组，每组各10只。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.2 菌株、质粒及主要试剂 pcDNA3.1（+）-GAD真核表达载体由杭州百替生物技术有限公司提供，E.coli DH5α、限制性内切酶HindⅢ、XhoⅠ以及DMEM培养基购自Gibco公司；T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；核酸提取试剂盒，胶回收纯化试剂盒，反转录试剂盒，Real-Time PCR试剂盒等购自TIANGEN公司；胎牛血清购自Hyclone公司。

1.3 方法

1.3.1 NSCs培养、电穿孔转染及GAD表达鉴定 常规分离初生SD大鼠大脑皮层组织，根据田志红等[4]的方法培养和鉴定NSCs。原代培养14d的NSCs，500g/min离心5min。用适量电穿孔缓冲液重悬细胞至5×108/ml，取500μl细胞悬液，加入20μg重组子质粒DNA，混匀后静置4min加到4mm电转化池中，在电压350V，电容100μF的条件下，电击1次，静置3min后将细胞转移至12孔板中，继续培养48h后，加入含G418的培养基筛选出稳定转染的细胞，Real-Time PCR检测电转前后GAD表达情况。提取转染前后细胞的总RNA，按试剂盒说明检测GAD基因的mRNA表达。设计上游引物：5′-AGATCTTACGAGCGTTGAAGGCCA-3′，下游引物：5′-TCCGAAGACCCAGATTTCCTTGCT-3′。

1.3.2 大鼠TBI模型建立 PBS组、NSCs组、GAD+NSCs组采用美国Am Scien Instruments公司FP302型颅脑损伤液压装置，参照Sun等[5]的颅脑液压损伤模型制备方法，大鼠用10%水合氯醛，按3.5g/kg的剂量对大鼠进行腹腔内注射麻醉后，将头部固定于立体定位仪，颅顶部剃毛、消毒，切开头皮至骨膜。于前囱后3.5mm、中线偏右2.0mm颅骨处钻孔，骨窗直径5.0mm，注意保持硬膜完整。用液压脑损伤撞击仪打击1次，打击强度（2.41± 0.05）ATM，模拟中度颅脑损伤。对照组不做处理。

1.3.3 细胞移植 将PBS组、NSCs组、GAD+NSCs组大鼠通过脑立体定向仪分别于骨窗边缘前、后1/3两点移植，每一移植点分别在皮下4mm及2mm深度进行[6]。PBS组仅移植10μl PBS；NSCs组移植10μl含有约5×108个NSCs的PBS；GAD+NSCs组移植10μl含有约5×108个转基因NSCs的PBS，每次移植后留针10min，缓慢退针5min，缝合头皮。

1.3.4 细胞凋亡的观察 分别于移植后1、10、20、30d时间点处死4组大鼠，取移植点附近2mm厚的脑组织，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）中固定24h后，进行石蜡包埋，将包埋好的脑组织蜡块进行连续切片，60℃烤箱内烤片1h进行固定。石蜡切片用TUNEL法检测颅脑损伤部位附近神经细胞的凋亡情况[7]。400倍光镜下取每个视野的凋亡阳性细胞数，细胞核蓝紫色为阳性，每张切片随机取6个视野，然后取平均值。

1.3.5 NSS神经功能评分[8]及旋转爬杆实验评分 分别于移植手术后1、10、20、30d对各组动物进行NSS评分，测试时进行3次，取其平均值。同时对照组大鼠进行评分。

1.3.6 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行分析，计量资料以表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 NSCs的体外培养及GAD在转基因细胞中的表达 原代培养第6天可见大小不等的悬浮生长的神经细胞球，机械吹打传代后，单个NSCs又继续形成神经细胞球（图1）。Real-Time PCR结果显示，GAD在转染后的NSCs mRNA表达增强（图2）。

图1 神经干细胞原代培养6d形成的神经干细胞球（×200）

图2 GAD的mRNA在转基因NSCs中的相对表达水平

2.2 各组大鼠不同时间点凋亡阳性神经细胞数比较 见表1。

表1 各组大鼠不同时间点凋亡阳性神经细胞数比较

由表1可见，对照组各时点凋亡阳性细胞数均低于其他3组。3组TBI大鼠比较，PBS组凋亡阳性细胞数均高于其余两组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；GAD+NSCs组凋亡阳性细胞数稍低于NSCs组，其中第10、20天差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 各组大鼠神经细胞凋亡情况（a：正常对照组；b：PBS组；c：NSCs组；d：GAD+NSCs组）

2.3 移植后各组大鼠NSS神经功能评分比较 见表2。

表2 各组大鼠不同时间点NSS神经功能评分比较

由表2可见，对照组各时点NSS神经功能评分均低于其他3组。3组TBI大鼠比较，PBS组NSS神经功能评分均高于其余两组，其中第20、30天差异有统计学意义（P＜0.05）；GAD+NSCs组凋亡阳性细胞数稍低于NSCs组，其中第10、20、30天差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

实验研究证明，移植转基因NSCs对中枢神经系统疾病的治疗有非常积极的作用[9]。本文结果显示，GAD+ NSCs组细胞凋亡数量最少。表明转基因细胞在移植到颅脑损伤部位后能够存活并且分化成神经细胞发挥作用，不仅能补充神经细胞数量，同时抑制了神经细胞的凋亡。

近年来的研究表明，在TBI后，受损部位的神经细胞会产生过量的兴奋性氨基酸（excitatory amino-acid，EAA）如：谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）等，EAA类神经递质兼有对神经元的兴奋作用和神经毒性作用，兴奋性强则毒性也强[10]，这些氨基酸能引起多种病理损害，致神经细胞水肿、空泡样变性和死亡；而抑制类氨基酸(inhibitory amino-acid，IAA)、γ-氨基丁酸（gamm a-aminobutyric acid,GABA）、牛磺酸（taurine, Tau）和丙氨酸（alanine,Ala）等则起到脑保护作用[11]。

以谷氨酸为代表的过量EAA与相应受体结合，一方面导致大量单价离子Na+、Cl-内流和K+外流,造成细胞水肿、变性和死亡；另一方面致大量Ca2+内流,使胞内Ca2+浓度升高,激活酯酶和蛋白酶,使胞内脂质和蛋白质分解，线粒体不可逆性坏死,最终使细胞死亡。脑损伤后组织损伤和广泛的膜去极化使谷氨酸超量释放,重摄取也发生障碍，除产生神经毒作用外,还增强了组织对缺血的敏感[12]。GAD基因修饰的NSCs的过量表达，一方面谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸生成GABA，降低了谷氨酸的含量，另一方面生成的GABA作用于受体可抑制EAA释放和钙离子内流，有降低颅内压、升高平均动脉压和脑灌注压和减小脑缺血梗死灶的作用。

有研究报道人类神经干细胞以及胚胎干细胞移植到脑损伤疾病小鼠的脑中，能够很好地存活及分化[13]。本研究结果显示，GAD+NSCs组和NSCs组在第10、20、30天神经功能评分均低于PBS组（P＜0.05）；GAD+NSCs组从第7天神经功能评分低于NSCs组（P＜0.05），表明在NSCs移植后14d，大鼠的神经功能有明显改善，而在转基因NSCs移植后7d大鼠神经功能就有明显改善，这说明尽管NSCs本身可以促进损伤组织的修复，但表达GAD的转基因NSCs可以更早地发挥神经保护作用。GAD可通过催化Glu生成GABA，而GABA属于保护性氨基酸类神经递质，可以促进颅脑损伤后脑功能的恢复[3]。

本研究表明，GAD修饰的NSCs移植到大鼠颅脑损伤部位后不仅可以在损伤的脑组织中存活，而且能够促进TBI后大鼠神经功能的恢复，为TBI疾病的治疗打下进一步的基础。

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Neural stem cells modified by GAD in treatment of rat traumatic brain injury AI Lingling,TAN Xiaodong,YANG Lulu.

Glutamic acid decarboxylase Neural Stem Cells Traumatic Brain Injury

2012-09-17）

（本文编辑：田云鹏）

311201 杭州市萧山区第一人民医院神经内科（艾玲玲）；南京师范大学生命科学学院细胞生物研究所（谭晓东、杨露露）

【 Abstract】Objective To investigate the effect of neural stem cells (NSCs)modified by glutamic acid decarboxylase (GAD)on rat traumatic brain injury. Methods GAD-transfected neural stem cells (GAD+NSCs group),wild neural stem cells (NSCs group)and PBS(PBS group)were transplanted into rats with traumatic brain injury.Neurological function was assessed by neurological severity score(NSS)in all groups after transplantation.TUNEL was employed to observe the cell apoptosis. Results The values of NSS in GAD+NSCs and NSCs groups were significantly lower than that of PBS group at 10h,d20 and d30 after cell transplantation(P＜0.05).The NSS scores in GAD+NSCs group were lower than those in NSCs group at d20 and d30(P＜0.05).At each time point,the rate of cell apoptosis in transplantation group was lower than that in model group(P＜0.05). Conclusion Neural stem cells modified by GAD can protect neural function in rats with traumatic brain injury.