I型鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞系中的增殖特性研究

付玉志，张洪辉，李传峰，陈宗艳，王 超，陈铁桥，刘光清*

(1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；3.濉溪县动物检疫站，安徽 淮北 235103)

I型鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由I型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1，DHV-1)引起的雏鸭的一种高度致死、快速传播的病毒性传染病。该病的特征为发病急、病程短、死亡率高。临床症状为痉挛、抽搐和角弓反张等，主要病理变化以肝脏肿大和斑点出血为特征[1-3]，是目前危害养鸭业一种重要的传染病。

DVH首次报道于美国长岛，随后在许多国家和地区陆续报道了该病疫情[4-6]。1965年，我国报道了第一例DVH疫情，之后我国大部分省市和地区均报道了该病[7]。目前，DHV-1的分离和培养仍然只能通过接种鸭胚或鸡胚来实现。一般而言，DHV-1经过若干代次的培养后，均可以在鸡胚或鸭胚中得到良好的增殖，并达到较高的病毒滴度，这有利于DHV-1强毒株的致弱以及研制DHV-1减毒疫苗。但在研究DHV-1的致病机理和分子生物学等方面，却有一定的局限性。研究表明，良好的细胞培养模型是开展病毒基础研究的良好平台，本研究在建立的鸭胚成纤维细胞(DEF-h)系的基础上，用DEF-h培养DHV-1，并研究其在细胞中的蛋白表达和增殖规律，为研究DHV-1的致病机理及研制细胞灭活疫苗等提供参考。

1 材料和方法

1.1 病毒株及DEF-h细胞系 DHV-1 ZJ-08株由本实验室分离并保存；DEF-h细胞系是通过逆转录病毒包装体系将SV40的大T抗原整合到的DEF细胞染色体中，利用大T抗原的细胞转化功能而建立的稳定传代细胞系。

1.2 主要试剂 rTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；FITC和HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DHV-VP1抗体和DHV-1多克隆抗体由本实验室制备并保存。

1.3 病毒接种DEF-h细胞 将DHV-1 ZJ-08株研磨液(0.2 mL/孔)接种于单层的DEF-h细胞，37℃孵育1 h，弃病毒液，更换含10%FBS的新鲜培养基，在5%CO2，37℃条件下培养，观察细胞病变(CPE)。培养4 d后，收获细胞培养物，-80℃冻存备用。

1.4 RT-PCR检测 收集培养48 h的3代DHV-1 DEF-h细胞提取病毒RNA。用特异性引物进行反转录获得cDNA，以其为模板，用特异性引物DHVF：5'-GGGGATGACTGTGTTCTG-3'，和DHVR 5'-GGG TATCCCACAACACTA-3'进行PCR扩增。预扩增大小为471个核苷酸序列(6966 nt～7436 nt)。PCR反应程序：95℃ 5 min；94℃ 1 min、53℃ 1 min、72℃1 min，30个循环；72℃10 min。产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 间接免疫荧光检测(IFA) 将DEF-h细胞培养于35 mm培养皿中，接种第3代DHV-1。培养48 h后，用丙酮∶甲醇(1∶1)固定液4℃固定15 min。用5%脱脂乳 37℃封闭30 min。 以DHV VP1抗体(1∶200)为一抗，标记以山羊抗兔 FITC-IgG(1∶1000)为二抗，进行IFA检测。

1.6 Western blot检测 将DHV-1细胞培养裂解物经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，用5%脱脂乳封闭4℃过夜，以抗DHV-VP1多抗(1∶200)为一抗，以山羊抗兔HRP-IgG为二抗(1∶5000)，通过DAB法显色进行检测。

1.7 DHV-1感染鸡胚试验 将30枚9日龄SPF鸡胚随机分为两组，每组各15枚。第1组接种DHV-1 ZJ-08株的细胞培养病毒液(P3)，第2组接种DHV-1 ZJ-08株适应鸡胚的尿囊液(CF5)，接种量为0.2 mL/只。在37℃条件下孵化6 d，统计病毒致死鸡胚的数量。

1.8 一步生长曲线的绘制 将DEF-h细胞悬液接种至96孔细胞培养板(3×105个/mL)，接种第3代DHV-1100 μL/孔，倍比稀释 10-1～10-6，37 ℃ 2 h后，吸出病毒液，加入100 μL完全培养基(含5%的胎牛血清)继续于37℃ 5%CO2培养箱中培养，观察CPE，并记录50%细胞产生病变的孔，根据Reed-Muench法计算不同时间点的半数组织感染量(TCID50)，并进行数据分析，绘制病毒在DEF-h中的一步生长曲线。

2 结 果

2.1 显微镜观察结果 DHV-1 ZJ-08株在DEF-h细胞中培养24 h后，可以观察到CPE，72 h更明显，主要表现为细胞间隙增宽、拉网、脱落、细胞崩解和死亡等特征，而对照细胞的形态则表现良好的生长形态(图 1)。

2.2 RT-PCR检测结果 采用RT-PCR方法检测经DEF-h细胞培养的第3代DHV-1的基因组。结果显示，扩增获得一条长约471 bp的特异性基因片段。该PCR产物的序列测定结果表明该序列与DHV ZJ-08株的基因序列同源性在99%以上。

2.3 IFA检测结果 DHV-1在DEF-h细胞中培养48 h后，经IFA检测结果显示，有大量特异性绿色荧光(图2)，表明DHV-1病毒蛋白获得了良好表达。

2.4 Western blot检测结果 采用western blot对感染DHV-1的DEF-h细胞进行免疫学检测，结果显示，在DEF-h细胞裂解物中能够检测到DHV-1 VP1的存在(分子量约26 ku)，而且能够与抗VP1的抗体特异性反应(图3)，表明表达产物具有良好的免疫原性。

图1 DHV-1病毒感染的DEF-h细胞(A-C)与正常DEF-h细胞(D)(400×)Fig.1 DEF-h Cells infected with DHV-1(A-C)and normal DEF-h cells(D)(400×)

图2 IFA检测DHV-1 VP1在DEF-h细胞中的表达(400×)Fig.2 Detection of DHV-1 VP1 expression in DEF-h cells by IFA(400×)

2.5 鸡胚感染试验结果 将在DEF-h细胞中培养3代的DHV-1接种9日龄鸡胚，观察6 d。结果表明DEF-h细胞中增殖的DHV-1能够致死鸡胚(48 h～96 h)，死亡率为80%(12/15)，而用鸡胚分离的第5代病毒对鸡胚的致死率仅为40%，提示DHV-1更容易适应DEF-h细胞。

2.6 DHV-1在DEF细胞中的增殖规律 一步生长曲线表明DHV-1在DEF-h细胞中的增殖规律为：DHV-1感染DEF-h细胞后12 h开始增殖，36 h～72 h进入一个快速增殖期，84 h病毒滴度达到峰值，病毒滴度为4.54 TCID50/mL。96 h后，病毒的增殖随着细胞的崩溃而降低(图4)。

图 3 Western blot检测DHV-1 VP1Fig.3 Detection of DHV-1 VP1 by western blot

图4 DHV-1在DEF-h细胞中的增殖规律Fig.4 One step growth curve of DHV-1 in DEF-h cells

3 讨论

目前，DHV的分离方法为采用SPF鸡胚或鸭胚分离，该方法虽然有效，但国内外研究均表明，DHV-1野毒株通常不易适应在鸭胚或鸡胚的增殖，往往需要盲传3代以上才能分离到病毒[8-11]。因此，用禽胚直接分离DHV比较费时，而且SPF鸭胚的来源也十分有限，不能随时获得，使得用鸭胚分离DHV-1的方法受到很大限制。为此，本实验室构建了一种永生化的DEF-h细胞系，该细胞系对DHV-1十分敏感，为开展DHV-1的相关基础研究提供了良好的平台。

本研究在建立DEF细胞系的基础上，研究DHV-1在DEF-h细胞系中的增殖特性，为进一步研究DHV-1的致病机理和病毒与宿主之间的相互作用等奠定基础。本研究表明，DHV-1野毒(ZJ-08株)第一代就可以适应DEF-h细胞，而且产生明显的细胞病变(48 h)，72 h病毒滴度为 4.3 TCID50/mL。在DEF-h细胞中连续增殖3代的DHV-1对鸡胚具有较强的致病性，致死率高于用鸡胚传代5次的DHV-1。表明用DEF-h细胞系分离DHV-1不仅比使用鸡胚或鸭胚分离病毒更便捷、易行，而且为开展DHV-1分子生物学研究提供良好的操作平台。

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