新疆古墓沟墓地人发角蛋白的提取与碳、氮稳定同位素分析

屈亚婷, 杨益民, 胡耀武*, 王昌燧

(1. 中国科学院 古脊椎动物与古人类研究所 脊椎动物演化与人类起源重点实验室, 北京 100044; 2. 中国科学院大学人文学院 科技史与科技考古系, 北京 100049)

0 引 言

通过古代人类食物结构的研究，可望揭示先民的生活方式、生存环境以及迁徙活动[1‒2]。其中，人骨中骨胶原的碳、氮稳定同位素分析，可以揭示该个体10年及以上的主要食物来源，成为探索先民食物结构的主要研究手段[3‒4]。与之相似，考古遗址中特殊情况下得以保留的人发，其碳、氮同位素分析同样可望探索其食物来源[5‒6]。

毛发由毛干和毛囊组成。毛干由外到内可分为毛小皮(包括上表皮和外表皮，由鳞片重叠而成)、皮质和髓质三层。毛发中的有机质部分，主要为角蛋白(富含胱氨酸残基和二硫键)。除髓质细胞的角蛋白二级结构为 β-折叠以外，毛小皮和皮质细胞的角蛋白均为 α-螺旋。2～3股 α-螺旋的角蛋白，可组成原纤维，进而形成细纤维，并最终形成粗纤维。大量粗纤维，再组成结构致密的纤维束，成为皮质的重要组成部分[7‒8]。根据“我即我食(You are what you eat)”原理[1]，生物组织的化学成分，与其食物密切相关。已有研究表明，在食物被消化吸收并转化为生物毛发角蛋白的过程中，碳同位素将发生一定程度的分馏，但分馏系数因动物种属不同而有所差异[9]，例如, 与食物相比，猪(Sus scrofa)毛发角蛋白 δ13C富集0.2‰[10]，沙鼠(Meriones unguienlatus)、牛(Bos Taurus)、美洲驼(Lama glama)则分别富集 1‰、2.7‰、3.5‰[11‒13]。而氮同位素则随着营养级的上升而发生分馏，约富集 2‰～3‰[14‒17]。与骨不同，毛发可持续生长，其生长速率因生物种属不同存在一定差异。因此，对生物毛发中角蛋白的碳、氮同位素分析，主要反映该个体短期内的食物来源[5‒6]。此外，通过对毛发角蛋白与骨胶原的碳、氮同位素比值的对比分析，还可深入探索该个体死亡前长期与短期内食物的变迁。

目前，通过对生物毛发中角蛋白的碳、氮稳定同位素分析，揭示该个体的食物结构，在国际生物考古界已有不少报道。例如，5200年前冰人发的δ13C和δ15N值分别为−21.2‰和7.0‰，表明该个体死亡前的一段时间内主要摄取C3类的植物[18]；努比亚木乃伊 X-Group(AD 350～550)的人群，其发根(−17.10‰)与发梢(−13.25‰)的 δ13C 值迥异，反映了该人群的食物存在季节性的变化[5]；冰河时期(BP 42700±1300)的猛犸象，其毛发中碳、氮稳定同位素比值的变化与其觅食环境的季节性变迁密切相关[19]。然而，与国际生物考古研究相比，尽管我国通过人骨中的碳、氮稳定同位素分析揭示先民食物结构的研究业已如火如荼、方兴未艾，但对毛发角蛋白的碳、氮稳定同位素分析迄今为止尚无任何报道。

中西方文化交流重要通道的新疆地区, 气候极其干燥，出土了大量的干尸或木乃伊，这为揭示该地区人群组成、生活方式乃至中西方文化的交流提供了重要的研究材料和线索。古墓沟遗址，代表了罗布淖尔地区青铜时代土著居民的考古学文化，14C测年表明，该墓地距今3800年前后[20‒21]。之前人骨中碳、氮稳定同位素以及微量元素的分析，表明古墓沟先民以肉食为主[22‒23]。为进一步了解先民短期的食物结构，本研究拟以新疆古墓沟墓地人发为研究对象，开展人发组织结构的显微分析，采用两种方法提取人发角蛋白，并分别进行碳、氮稳定同位素分析。此外，还通过与骨胶原中碳、氮稳定同位素比值的相互比较，探索该个体在不同时间内食物来源的差异以及发与骨之间同位素分馏的可能原因。

1 材料与方法

1.1 材料的选择

本次分析样品取自于M5 (为约6岁小孩)中的骨骼(图 1)和头发(图 2)。

图1 古墓沟人骨样品Fig.1 The bone sample from Gumugou cemetery

图2 古墓沟人发样品Fig.2 Hair samples from Gumugou cemetery

1.2 实验方法

1.2.1 显微观察

观察人发鳞片结构破损状况，可为判断其保存状况提供重要依据。采用光学显微镜(型号：Nikon ECLIPSE LV100 POL)在500倍下观察现代和古代人发的表面结构(图3)。

图3 现代人发显微结构(a)和古墓沟人发显微结构(b)Fig.3 The microstructure of modern hair (a),The microstructure of ancient hair (b)

1.2.2 蛋白质的提取

(1)骨胶原的制备 机械去除骨骼样品内外表面的污染物, 称量。4 ℃下 HCl (0.5 mol/L)浸泡，2～3 d换酸，直至无气泡产生且骨变得柔软透明。蒸馏水洗至中性，4 ℃下浸于NaOH溶液(0.125 mol/L)，再次洗至中性。加入HCl (0.001 mol/L)，70 ℃下48 h，趁热过滤后冷冻干燥得明胶化的骨胶原。称取骨胶原质量，计算骨胶原的产率(骨胶原/骨质量)。

(2)头发样品的预处理 方法一：称取约 1 mg人发(编号为 1号)，切除人发根部的毛囊。室温下蒸馏水超声清洗30 min，无水乙醇超声清洗30 min，新鲜无水乙醇4 ℃下浸泡1 d，以去除人发上的油脂[18]，自然干燥。方法二：称取约1 mg人发(编号为2号)，切除人发根部的毛囊。室温下蒸馏水超声清洗30 min，HCl (0.125 mol/L)超声清洗30 min，蒸馏水洗至中性。无水乙醇超声清洗30 min，新鲜无水乙醇4 ℃下浸泡1 d，以去除人发上的油脂，自然干燥。

1.2.3 C、N含量及稳定同位素比值的测试

取少量骨胶原或处理后的人发1、2号样品，称重，于Elementar Vario-Isoprime100型稳定同位素质谱分析仪(中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所环境同位素实验室)上测试其C、N含量及同位素比值。测试C和N含量所用的标准物质为磺胺(Sulfanilamide)。碳、氮稳定同位素比值分别以USGS 24标定碳钢瓶气(以PDB为基准)和IEAE-N-1标定氮钢瓶气(以AIR为基准)为标准，每测试10个样品中插入 1个实验室自制胶原蛋白标样(δ13C值为(−14.7±0.15)‰, δ15N 值为(6.88±0.2)‰)。分析精度都为±0.2‰, 碳、氮同位素比值分别以 δ13C(相对V-PDB)和δ15N(相对AIR)表示, 测试结果详见表1。

表1 骨胶原和发角蛋白的C、N含量及同位素比值Table 1 The C, N contents and isotopic data in bone collagen and hair keratin

2 结果与讨论

2.1 骨和发的污染

生物体死亡之后，在长期的埋葬过程中常受到各种埋藏环境因素的影响[24‒25]，可能导致骨(发)中化学成分发生明显变化，造成样品的污染[26‒27]，使得食物结构的重建无从谈起。因此，探索骨(发)中的蛋白质是否发生了污染是开展稳定同位素分析的前提。

2.1.1 骨胶原的保存状况

对于骨胶原而言，其C、N含量和C/N摩尔比，是判断其保存的重要鉴定指标[28]。与现代骨胶原的C(41%)、N(15%)含量相比[29]，古墓沟人骨胶原的C、N含量相对较高，分别为47.6%和17.3%，表明保存较为完好。一般认为，胶原蛋白的C/N摩尔比值在2.9～3.6之间，可认为未受污染[28]。古墓沟人骨的C/N摩尔比值为3.2，落于此范围内，进一步表明该个体的骨胶原基本未受污染。

2.1.2 人发的保存状况

通过显微观察，可初步了解古发的保存状况。与现代人发的完整鳞片结构(图 3a)相比，古发的鳞片结构已完全破坏，但发的骨架结构较好，仍具有一定的韧性(图 3b)。究其原因，主要是由于发毛小皮和皮质所含的高硫蛋白受到埋藏环境中各种物理、化学以及生物因素的侵蚀被破坏, 并且毛小皮细胞之间以及毛小皮与皮质细胞之间的细胞膜络合物(cell membrane complex，简称CMC)明显减少，最终导致鳞片的破损、翘起和脱落[30]。

人发角蛋白的C/N摩尔比是判断其保存状况的最关键指标[18]。角蛋白的 C/N摩尔比值通常落于2.9～3.8之间[17]。而经过两种方法处理的古墓沟人发，其C/N摩尔比值皆为3.7，可视为未受污染。

另一方面，比较人发处理的两种方法可以明显看出，1号样品的C(42.6%)和N(24.0%)含量，皆显著高于2号样品(C、N含量分别为13.3%和7.5%)，表明酸处理会使人发角蛋白中的 C、N含量降低。如前言所述，稳定角蛋白二级结构的化学键中存在大量的二硫键，在酸性环境下很容易断裂，使得角蛋白发生降解，产生水溶性的多肽或游离氨基酸[31‒32]，在处理过程中很容易流失，这应当是造成角蛋白C、N含量下降的主要原因。

2.2 M5个体的食物结构

图4 同一个体骨胶原和角蛋白的δ15N-δ13C散点图Fig. 4 Scatter plot of δ15N and δ13C values of bone collagen and hair keratin from the same individual

M5人发样品1和样品2以及骨胶原的碳、氮稳定同位素比值关系如图 4所示。由图可见，样品 1和样品2的δ13C和δ15N值非常接近, 表明尽管对人发的处理方法有所差异，但并不影响人发角蛋白的碳、氮稳定同位素比值。若平均样品1和样品2的δ13C和δ15N值，可得人发角蛋白的δ13C和δ15N值分别为−18.8‰和14.8‰。若以人发的生长速度为每天生长0.35 mm[33]计算，则M5人发(长度为8.77 cm)反映了该个体死亡前约 250 d的平均食物组成。如前言所述，骨中的δ13C和δ15N值主要反映了个体死亡前至少 10年的平均食物组成[3]。故此，通过对M5发与骨中的δ13C和δ15N值分析，即可了解其短期与长期的食物构成。

众所周知，C3植物的 δ13C 值为−30‰ ～ −23‰(均值−26.5‰)，C4植物的 δ13C 值为−9‰ ～ −16‰(均值−12.5‰)[34]。与食物的 δ13C 值相比，人(动物)肌肉约富集1‰，骨胶原约富集5‰左右[35]。依此，从图4可以明显看出，发与骨的 δ13C值(分别为−18.8‰和−18.3‰)显现出典型的 C3类特征，表明先民的食物主要来源于 C3类的植物抑或以 C3类植物为食的动物。就氮同位素而言，自食物转化为骨胶原或发角蛋白过程中，δ15N 值大约分别富集 3‰～4‰和2‰～3‰[36‒37]。显然，发与骨的高 δ15N 值(14.8‰和15.5‰)表明先民的食物中包含了大量的动物蛋白。综上所述，可以看出，M5个体的食物来源一直相当稳定，动物蛋白在其食物中居主导地位。

新疆地区是中西方交流的重要通道，畜牧业一直是先民最重要的生计之一。公元前2000年初，新疆地区出现的小河-古墓沟文化(以小河墓地和古墓沟墓地为代表)，其人群组成主要为欧洲人种。墓地中的随葬品，除常见的细石器镞、铜刀、骨角器、牛羊骨骼和皮毛制品外，还存在石镰和石磨盘(石磨棒)等农业工具及小麦和粟等植物遗存，显示人群的生活方式可能主要为畜牧狩猎经济并辅以少许农业[21,38‒41]。之前，古墓沟墓地其他10个人骨样品的δ13C和δ15N平均值分别为(−18.2±0.2)‰和(14.4±0.52)‰，显示该墓地的先民主要以畜牧业为生[22]。本研究中，M5发与骨中δ13C和δ15N值的对比分析进一步证实：先民经营畜牧业产生的大量动物肉类是先民最重要的食物来源。

2.3 骨胶原与角蛋白之间的同位素分馏

当食物被消化吸收后，因人(动物)的不同组织所需碳源的不同，造成了不同组织与食物之间碳同位素的分馏，使之存在明显差异。一般而言，与食物中的δ13C值相比，肌肉约富集1‰，骨胶原约富集5‰，羟磷灰石结构碳酸根中约富集 12‰[37]，毛发角蛋白约富集0.2‰～3.5‰[10‒13]。此外，动物饲喂实验进一步显示：骨胶原中的碳主要源自食物中的蛋白质部分，而羟磷灰石的碳则来自整个食物(包括碳水化合物、蛋白质和脂类)，发角蛋白中的碳也主要源自食物中的蛋白质部分[42‒43]。

已有的研究显示，骨胶原蛋白相对于毛发角蛋白，其 δ13C值富集 0‰～1‰，而 δ15N值富集 0‰～2‰[44‒45]。在本研究中，M5骨胶原与发角蛋白均具有高δ15N值，表明该个体绝大部分的食物来自动物蛋白。骨胶原与发角蛋白之间的 δ13C值之差仅为0.5‰，说明两者的碳源非常相似。此外，骨胶原的δ15N值较发角蛋白仅富集0.7‰，也反映了两者之间具有相似的氮源。故此，可以看出，当食物以高蛋白为主时，骨与发之间碳、氮同位素的分馏效应较小。然而，当食物以碳水化合物为主时，骨与发之间的同位素分馏是否存在一定的规律，尚有待进一步研究。

另一方面，骨胶原与角蛋白在δ13C和δ15N值的差异除与先民短期与长期内食物来源的不同密切相关外，还缘于两者不同的氨基酸组成。角蛋白由22种氨基酸组成，以胱氨酸、甘氨酸和酪氨酸为主[31,46]；骨胶原的氨基酸则主要为甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等[47]。研究表明，不同氨基酸因其代谢途径的多源性，往往造成不同氨基酸的δ13C和δ15N值与食物相比存在不同程度上的分馏效应[48‒49]。由此可见，发与骨的蛋白之间δ13C和δ15N值的少许差异与其各种不同氨基酸组成造成的同位素分馏效应也密切相关。

3 结 论

比较了新疆孔雀河古墓沟遗址 M5人发与现代人发的组织结构，采用两种方法提取古发中角蛋白，并对该个体骨与发中碳、氮稳定同位素进行了对比分析，结论如下。

(1)与现代人发显微结构相比，古墓沟人发骨架结构保存较好。古发的C、N含量以及C/N摩尔比显示其未受污染。角蛋白提取过程中，酸处理虽不影响碳、氮稳定同位素比值，但会导致其含量明显降低。因此，毛发角蛋白提取，不适于酸处理。

(2)角蛋白低 δ13C 值(−18.8‰)和高 δ15N 值(14.8‰)表明该个体死亡前大半年内摄取了大量动物蛋白。与该个体骨胶原(反映先民长期内食谱信息)的 δ13C 值(−18.3‰)和 δ15N 值(15.5‰)相比，可以看出，该个体的食物来源一直较为稳定，即以大量动物蛋白为食，主要源自发达的畜牧业。

(3)尽管角蛋白与骨胶原有着不同的氨基酸组成，但两者之间δ13C和δ15N值的细微差异可能与该个体以高蛋白为主的食物分别转化为骨和发中蛋白的过程中，骨与发之间碳、氮同位素的分馏效应较小有关。

综上所述，通过对人骨中骨胶原与人发角蛋白的δ13C和δ15N的对比分析可揭示个体食物结构的变迁。而将人发作为研究材料，无需破坏遗骸的完整性，这为在新疆地区大力开展先民的食物结构分析奠定了基础。此外，作为中西方交流重要通道的新疆地区，人口流动极为频繁，而通过对富含高硫蛋白的人发中的硫稳定同位素分析[50‒51]，还可为探讨新疆地区的人群迁徙和人群结构等热点问题提供重要线索。

感谢中国科学院大学陈相龙、侯亮亮、王宁、司艺和李文成等研究生在本文的实验和文章撰写过程中的指导。

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