不同激素对红豆杉愈伤组织诱导及增殖的影响

韩晓红，李 磊，段春红

（武汉生物工程学院 生物工程系，湖北 武汉430415）

1 引言

红豆杉（Taxus）是红豆杉科（Taxaceae）红豆杉属（Taxus）植物的总称[1]，从中提取的紫杉醇以其独特的治癌机理和疗效显著而风靡全球，从而促成了世界性开发红豆杉和提取紫杉醇的新潮流。全球共有11种红豆杉，分布于北半球的温带及亚热带地区，在我国有4个品种及1个变种：东北红豆杉（T.cuspidata）、云南红豆杉（T.yunnanensis）、西藏红豆杉（T.wallichiana）、中国红豆杉 （T.chinensi）、南 方 红豆 杉 （T.chinensis varmairei），其中中国红豆杉和南方红豆杉为我国所特有[2]。

由于红豆杉生长极其缓慢，种子存在休眠与后熟难以繁殖，内生菌种类与数量多，愈伤组织易褐变及生长不稳定和紫杉醇市场需求大、利润高，因此通过体外植物组织培养获得试管苗运用于观赏盆景、工业木材和细胞悬浮培养高产紫杉醇都有巨大的科研、商业前景。本试验以南方红豆杉的嫩茎为外植体，探讨了不同激素组合和浓度对愈伤化诱导及其愈伤组织继代增殖培养的影响，为生产红豆杉试管苗和实现紫杉醇工业化生产提供一定的技术参考。

2 材料与方法

南方红豆杉无菌嫩茎由武汉生物工程学院植物细胞工程实验室提供。

2.1 不同激素对于红豆杉愈伤组织诱导影响试验

截取无菌嫩茎1cm左右，以B5＋蔗糖20g/L＋琼脂8g/L＋AC1g/L＋酪蛋白1g/L为基础培养基，添加激素2，4－D、6－BA和 NAA（组合见表1），探求其对嫩茎愈伤化的影响，每只试管接种1个茎段，每个处理重复16次。观察统计30d和60d后的愈伤化诱导情况，计算愈伤组织诱导率和褐化率。其中，愈伤组织诱导率＝（愈伤化总数/接种外植体总数）×100%，褐变率＝（褐变数/愈伤化的外植体总数）×100%。

表1 红豆杉愈伤组织诱导的激素设计

2.2 不同激素对红豆杉愈伤组织细胞继代增殖影响

2.2.1 探讨NAA对愈伤组织继代增殖的影响

在试验基础上，提高NAA浓度，并搭配KT0.5mg/L，选 用 NAA3.0mg/L、NAA4.0mg/L、NAA5.0mg/L分别进行愈伤诱导试验，基础培养基为B，5（去掉 Cu2＋的 B5培养基）＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L＋蔗糖20g/L＋琼脂8g/L，每个处理接种愈伤组织16只试管，培养30d观察愈伤生长情况并称其鲜重，并计算愈伤组织生长值和愈伤组织生长指数。其中，愈伤组织生长值（mg）＝收获鲜重－接种鲜重，愈伤组织生长指数＝（收获鲜重－接种鲜重）/接种鲜重。

2.2.2 探讨KT对愈伤组织增殖培养的影响

在试验确定NAA浓度基础上，设计KT浓度梯度KT0mg/L，KT0.5mg/L，KT1.0mg/L，从而确定对于红豆杉愈伤组织增殖的最佳KT浓度。基础培养基为B，5（去掉Cu2＋的B5培养基）＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L＋蔗糖20g/L＋琼脂8g/L，每个处理重复16次，培养30d称其鲜重，计算愈伤组织生长指数。

3 结果分析

3.1 不同激素对于红豆杉愈伤组织诱导的影响

选用不同浓度的2，4－D与6－BA组合、NAA与6－BA组合进行嫩茎愈伤化诱导试验，统计其30 d、60 d的诱导率及褐变率（表2）。

表2 激素对红豆杉嫩茎诱导愈伤组织的影响

由表2可知，2号培养基（2，4－D2.0mg/L＋6－BA0.5mg/L）中愈伤组织诱导率达到100%，褐变率较低，比较适合诱导红豆杉嫩茎的愈伤化。比较两组激素搭配，可见生长素2，4－D比NAA诱导愈伤化的作用效果更明显（图1），但高浓度的2，4－D容易导致褐变，因此诱导红豆杉嫩茎愈伤化的最佳激素组合为：2，4－D2.0mg/L＋6－BA0.5mg/L。

图1 愈伤化的嫩茎（2，4－D2.0＋6－BA0.5）

3.2 不同激素对红豆杉愈伤组织继代增殖影响

3.2.1 NAA对于红豆杉愈伤组织增殖的影响

由诱导试验可知愈伤组织长期处于2，4－D的培养基上易褐化和引起细胞癌变；同时相对于6－BA，KT对减轻褐化有更明显的效果[3]，且由表2可知低浓度的NAA（NAA1.0和NAA2.0）对促进外植体愈伤化没有明显的效果，因此以B，5（去掉Cu2＋的B5培养基）＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L＋蔗糖20g/L＋琼脂8g/L为基础培养基，添加较高浓度的NAA（浓度梯度为：NAA3.0mg/L、NAA4.0mg/L、NAA5.0mg/L），同时搭配KT0.5mg/L进行愈伤组织的增殖试验，30 d后对增殖结果进行统计，其生长指数见表3。

表3 NAA对愈伤组织增殖的影响

培养30d后，在NAA浓度为4.0mg/L时，愈伤组织增殖效果最好（图2），平均生长值达到2.322g，由此可知NAA浓度在4.0mg/L时是南方红豆杉愈伤组织增殖的最佳浓度。

图2 增殖培养的愈伤组织

3.2.2 KT对红豆杉愈伤组织增殖的影响

在筛选出增殖的最佳NAA浓度的基础上，探求不同浓度的 KT（KT 的浓度梯度为：0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L）对愈伤组织增殖培养的影响，培养一个月后观察愈伤组织增值情况并称重，其生长指数结果见表4。其中当KT浓度为0.5mg/L时，愈伤组织增殖效果最好，生长指数可达0.983±0.030，由此可知KT浓度为0.5mg/L时，愈伤组织增殖效果最好。

表4 KT对愈伤组织继代培养影响试验结果

4 结语

盛长忠等[4]研究发现，2，4－D比 NAA更有利于愈伤组织的形成，以2.0mg/L时效果最好。培养基中添加CA（酪蛋白）、PHE和乙酸钠能促进愈伤组织生长和紫杉醇积累，其中CA0.5mg/L时生长量最大。李斌连等[5]认为，从芽诱导出来的愈伤组织颜色较浅，出愈时间较早，而从茎段和叶片诱导出的愈伤组织颜色浓绿，以后继代过程中易发生褐化，因此，侧芽是诱导愈伤组织最佳的外植体。低浓度的CA（酪蛋白，0.1%～0.5%）能参与细胞分裂和生长的代谢活动，促进愈伤组织的生长，浓度较高时，不仅抑制天然氨基酸的正常合成，而且CA中过量的芳香族氨基酸进入次级代谢途径，产生许多酚类物质，使愈伤组织褐化，抑制其生长[6]。本试验以嫩茎为外植体，愈伤组织诱导的最佳培养基为：B5＋2，4－D2.0mg/L＋6－BA0.5mg/L＋蔗糖20g/L＋琼脂8g/L＋AC1g/L＋酪蛋白1g/L；继代培养的最佳培养基为：B，5（去掉 Cu2＋的B5培养基）＋NAA4.0mg/L＋KT0.5mg/L＋蔗糖20g/L＋琼脂8g/L＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L。获得稳定的愈伤组织是工业化生产紫杉醇的关键所在，在试验过程中发现较高浓度的2，4－D能短时间内诱导外植体愈伤化，但在其上面继续培养便很快褐化、死亡。如果把2，4－D培养基上刚形成的愈伤化细胞团立即转移到较高浓度的NAA培养基上便能防止细胞褐化，以后每隔一个月左右继代一次便可使愈伤组织持续稳定生长，便可获得稳定的愈伤组织，为实际生产提供了一定的技术参考。

[1]梁珍海，刘根林，徐 锋.红豆杉属植物组织培养及其快速繁殖研究综述[J].江苏林业科技，2001，28（3）：45～47.

[2]包维楷，陈庆恒.中国的红豆杉资源及其开发研究现状与发展对策[J].自然资源学报，1998，13（4）：375～380.

[3]王 水，贾勇炯，魏 峰，等.云南红豆杉的组织培养及植株再生[J].云南植物研究，1997，19（4）：407～410.

[4]盛长忠，王淑芳.南方红豆杉愈伤组织培养研究[J].中草药，2000，31（2）：57～59.

[5]李斌连，邱 萃，刘金仙，等.南方红豆杉愈伤组织诱导和继代培养体系的建立[J].福建农林大学学报，2006，35（5）：515～518.

[6]甘烦远，郑光植.红豆杉细胞培养的研究[J].云南植物研究，1996，18（2）：134～138.