大孔树脂分离纯化文冠果种仁中总皂苷

王清亭，王晓东，赵 兵

（1.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100190；2.中国科学院大学，北京100049）

文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge），属无患子科（Sapindaceae）文冠果属（Xanthoceras），主要分布于我国北方，是传统木本油料树种，种仁含油率为55%～66%[1]。其种仁除油脂可作食用及生产生物柴油以外，油渣中含有皂苷类物质，目前研究结果显示其具有抗癌[2]、治疗遗尿症[3]、抑制HIV蛋白酶[4]、改善学习记忆功能[5]的效果，可开发成为改善智力的药物。文冠果皂苷是一类次生代谢产物，结构复杂，含量少，在种仁中的含量低于油脂和蛋白，在0.5%～2%之间[6-7]，这些因素加大了皂苷提取和纯化的难度。皂苷类化合物纯化多采用溶剂萃取法或硅胶柱层析法[8]，但萃取法消耗大量有机溶剂，硅胶吸附层析法对原料预处理要求高且成本高，而大孔树脂分离法近来越多地应用于中草药有效成分的分离纯化中[9-11]，具有化学稳定性高、选择性好、吸附速度快、可重复利用、节省费用等诸多优点。目前，未见有利用大孔树脂对文冠果种仁残渣中皂苷进行分离纯化的研究，本文研究了皂苷在几种常用树脂下的吸附解吸性能，选择适合于文冠果种仁皂苷的树脂，考察了所选树脂下主要因素对吸附解吸效果影响，确定了最佳工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

文冠果种子 陕西省志丹县；齐墩果酸对照品中国药品生物制品检定所；AB-8、ADS-7、D113、HPD-400A、NKA、HPD-722、D101、HPD-100树脂 天津南开大学化工厂；860021树脂 山东鲁抗树脂分厂；无水乙醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛等 均为分析纯；

2802 紫外可见分光光度计 中国UNIC公司；HZQ-QG恒温振荡器 中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司；旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FE-20精密pH酸度计 瑞士Mettler Toledo；玻璃层析柱 北京金志业仪器设备有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 文冠果皂苷粗提液的制备[12]将文冠果种子人工破壳，取种仁干燥、粉碎均匀，用石油醚按1∶20的固液比，70℃下加热回流提取油脂三次，提取液真空抽滤后，脱脂物放60℃烘箱烘干至恒重，得到脱脂粉，再用此脱脂粉以70%乙醇作为提取溶剂，超声辅助提取，提取液真空抽滤，得滤液旋转蒸发除去溶剂，得到皂苷粗提物浸膏，用去离子水复溶作为皂苷粗提液。

1.2.2 大孔树脂预处理 实验选取了文献中常用的树脂，包括D101、AB-8、HPD系列以及其他几种树脂。取树脂适量置于三角瓶中，在30℃恒温振荡箱中，用无水乙醇浸泡12h，然后用去离子水冲洗至无醇味，再用5%的盐酸溶液浸泡3h，然后去离子水冲洗至中性，再用5%的NaOH溶液浸泡3h，最后用去离子水洗至中性，备用。

表1 不同树脂的性能参数Table 1 The physical chracters of macroporous resins

1.2.3 总皂苷含量的测定[13]准确吸取新配制的1.0mg/mL的齐墩果酸标准溶液0、20、40、60、80、100、120μL，分别加入6支干燥具塞试管中，沸水浴挥干甲醇，各加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，于60℃恒温水浴中加热15min，取出，流水冷却5min，加冰醋酸5mL，摇匀，在550nm波长处测定吸光度。三次平行重复，以三次吸光度的平均值A为纵坐标，齐墩果酸标准品含量C（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程：A=7.7623C-0.0172，R2=0.9977。按照上述同样的方法处理样品，根据所得回归方程计算样品中总皂苷含量。

蛋白质测定采用Bradford法[14]，糖类测定采用苯酚-硫酸法[15]。

1.2.4 树脂静态吸附解吸性能的测定 取已处理好的树脂各10mL，精密移取样品液25mL，置100mL锥形瓶中，摇匀，把锥形瓶置于30℃，转速为60r/min的恒温振荡器进行吸附，静置12h。精密吸取上层液0.1mL，测得吸光度A值并计算静态吸附量。

式中，C0、C分别代表上样液中（吸附前）总皂苷的浓度和吸附后样液中总皂苷的浓度（mg/mL）；V代表样液体积；Vs代表树脂体积。

1.2.4.1 树脂静态解吸性能的比较 分别将上述充分吸附了总皂苷的树脂滤出，于滤纸上吸干样液，精密加入70%的乙醇100mL于锥形瓶中，60r/min振摇4h，静置后，精密吸取上层液0.1mL，测定洗脱液中总皂苷的含量。分别计算吸附量、吸附率、解吸率、皂苷含量，解析率和皂苷含量的计算公式如下：

式中，C1、C分别代表解吸液中和吸附后样液中总皂苷的浓度（mg/mL）；C0代表样液浓度；V代表样液体积；C测、V测分别代表测定浓度和体积；M代表测定固形物质量。

1.2.4.2 大孔树脂静态吸附动力学特性 取筛选过的预处理过的大孔树脂5.0mL，置于100mL三角锥形瓶中，加入总皂苷浓度0.6mg/mL提取液20.0mL，分别在室温条件下吸附0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h 后吸取0.1mL上层清液，测定吸附量，绘制静态吸附曲线。

1.2.5 动态吸附实验 用筛选出的大孔树脂进行湿法装柱，分别考察上样流速、上样液pH、上样量等因素，分别在不同上样量、上样液pH（3.5～7.5）、上样流速（0.5～4mL/min）条件下收集各流出液，测定皂苷的吸附量，以吸附量为指标确定最佳吸附条件。

1.2.6 动态解吸实验 包括洗脱剂浓度及其体积的选择，洗脱曲线的绘制。

将上样液pH调至4.5上柱（柱体积15mL，径高比1∶5），上样流速0.5～1mL/min，先用一定体积蒸馏水洗脱，然后用50%和70%浓度的乙醇溶液进行洗脱，分管收集洗脱液，测定其中总皂苷的浓度，确定最佳的洗脱过程。

1.2.7 清除亚硝酸盐活性实验 采用对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺分光光度法[16]。

2 结果与分析

2.1 树脂静态吸附性能的比较

图1 不同树脂吸附能力比较Fig.1 Adsorption capacity of 8 macroporous resins on saponin from seed kernel of X. sorbifolia

本实验测定了8种不同结构参数的树脂对文冠果皂苷的吸附解吸性能。由图1看出，吸附量较高的树脂是NKA、ADS-7、860021树脂，这三种树脂有着不同的极性，但其吸附量比较接近，可见树脂的极性对文冠果皂苷的吸附效果并无较大影响。实验过程中发现NKA树脂装柱上样后，流速太慢，洗脱峰杂，没有明显目标产物峰，并不适合于生产制备。

而ADS-7树脂是双功能吸附树脂，具有优良脱色功能，实验中的提取液呈现浅黄色，而皂苷本身并无紫外吸收，由于带有不同功能基，不是靠单一的物理吸附进行吸附，而由不同作用吸附的物质可用不同的洗脱剂分别洗脱[17]，因此可用于分离不同的物质。

2.1.1 静态吸附动力学曲线 由图2可知，大孔树脂ADS-7对皂苷的吸附在1h左右基本吸附平衡，2h后吸附量基本不再变化，860021树脂在2h后才达平衡，也说明ADS-7树脂对文冠果总皂苷的吸附为快吸附，此树脂能够节省时间，提高效率[18]。因此，综合考虑，后续实验采用ADS-7树脂作为纯化文冠果皂苷的树脂。

图2 ADS-7和860021树脂静态吸附动力学曲线Fig.2 Dynamic curves for static adsorption of total saponin on resin ADS-7 and 860021

2.1.2 上样液浓度对吸附效果的影响 由图3得出，随着上样浓度的增加，吸附率先增加后减少。低浓度时，选择性低，比较耗时；高浓度时，由于表面吸附分子过多，阻碍了其他分子进入树脂内部，导致吸附率下降，而且浓度较高时容易堵塞树脂柱，为后续的洗脱及树脂的再生造成困难，因此浓度太低或高都不合适。因此，上样浓度选择为0.6mg/mL。

图3 上样浓度对吸附的影响Fig.3 Effect of stock solution concentration on the adsorption efficiency

2.1.3 上样液pH对吸附效果的影响 不同pH下的吸附效果如图4。文冠果皂苷因结构上羟基的存在显示出一定的酸性特征，因此，弱酸性条件下，皂苷结构多以分子形式存在，更易借助氢键及范德华力发生吸附。而强酸条件下，皂苷中糖苷键会发生水解，强碱条件下，皂苷会以离子形式存在，不利于吸附。结果显示，上样液pH在4.5附近时，吸附率达到最大，而且，实验过程中调节pH，可以看到明显的混浊现象出现，这是由于pH接近了杂质蛋白的等电点的缘故，导致蛋白质析出。因此后续实验，将pH调至4.5后再上柱。

图4 上样液不同pH对吸附效果的影响Fig.4 Effect of pH values on the adsorption efficiency

2.2 动态吸附及解吸

2.2.1 吸附及解吸流速的确定 在大孔树脂纯化过程中，上柱流速是影响树脂动态吸附效果的关键因素之一，由实验结果图5可知，随着上样流速的增大，树脂的吸附量降低，虽然下降幅度不大，但是流速过快，不利于皂苷充分吸附到树脂内表面，流速过慢，又会延长吸附时间，降低效率。综合考虑，吸附流速控制在1mL/min，即4BV/h左右，洗脱流速也是如此。

图5 流速对吸附及解吸效果的影响Fig.5 Effect of flow rate on adsorption and desorption efficiency

2.2.2 动态解吸条件的确定

2.2.2.1 解吸剂浓度对解吸效果的影响 考虑到溶剂毒性以及易于回收和后处理等因素，以乙醇溶液作为解吸溶剂。乙醇溶液浓度从两方面影响有效成分在大孔吸附树脂上的吸附。一方面，乙醇浓度不同，极性不同，影响有效成分和大孔吸附树脂间的分子间作用力。另一方面，乙醇浓度不同，影响有效成分在乙醇溶液中的溶解度。解吸作用是两方面共同作用的结果。

结果如图6所示，解吸率随着乙醇浓度的增大而呈上升趋势，乙醇体积分数在70%开始，再增大浓度，洗脱量变化不大，还有所下降，这表明70%的醇溶液接近文冠果皂苷的极性，解析效果佳，因此上柱洗脱采用70%乙醇溶液作为皂苷的主要洗脱剂。

图6 不同解吸剂浓度对解吸效果的影响Fig.6 Effect of different ethanol concentrations on desorption efficiency

2.2.2.2 洗脱过程考察 以4BV/h流速解吸，分段收集流出液，测定总皂苷浓度，50%以上乙醇浓度洗脱率较高，静态洗脱过程不完全代表洗脱效果，因此着重考察了50%乙醇浓度和70%乙醇浓度的动态洗脱过程，以解吸液中皂苷质量浓度对洗脱体积作曲线，结果如图7所示。

图7 水洗体积的确定Fig.7 Determination of volume of eluting distilled water

图8 50%和70%乙醇洗脱曲线比较Fig.8 Dynamic elution curves of saponin by 50% and 70% ethanol

种仁提取物主要包含蛋白质，糖类物质等，水洗量大致可以由检测这两种物质确定。由图7可看出，2BV的水洗过程基本洗脱未被吸附的以及易被水洗脱的物质。由图8可得，50%乙醇浓度比70%乙醇浓度洗脱峰出现晚，且峰值明显低于70%醇浓度。由此确定，用70%乙醇浓度洗脱，收集前3BV的洗脱液。

因此，确定洗脱顺序为：先用2BV的去离子水，然后用3BV的70%乙醇溶液洗脱，含量在32.2%±2.2%。

2.2.2.3 洗脱过程的改进 通常情况下洗脱剂极性越小，其洗脱能力越强，一般先用蒸馏水洗脱，再用浓度逐渐增高的乙醇、甲醇洗脱。多糖、蛋白质等水溶性杂质会随着水流先下，极性小的物质后下。对于有些物质还可以用不同浓度的酸、碱液结合有机溶剂进行洗脱。

实验对于70%乙醇洗脱剂的不同pH进行考察，发现不同pH下并无明显差异（图9）。

图9 不同pH对解吸效果的影响Fig.9 Effect of pH values on the desorption efficiency

ADS-7树脂对于皂苷的吸附率较高，但是解吸率不高，可能原因是：ADS-7树脂是极性树脂，兼具表面吸附和基团交换的功能，对多羟基的皂苷有较强的吸附作用，同时，树脂本身具有一定碱性，可以与多羟基文冠果皂苷形成离子键，两种作用导致吸附力强[19]。但是由图9可知，改变pH，并未明显改变其解吸率。因此，离子键在此并非主导作用，考虑表面吸附是主导，在70%乙醇解吸基础上，再用90%乙醇进行解吸，考察该过程解吸效果，如图10所示。

图10 70%乙醇洗脱后再用90%乙醇洗脱效果Fig.10 The results of elution with 90% ethanol following 70% ethanol

图10中，前3BV洗脱液为70%乙醇，后3BV为90%乙醇，总解吸率达95.8%。

最终洗脱顺序定确定为：先用2BV的去离子水，然后用3BV的70%乙醇溶液洗脱，再用2BV的90%乙醇洗脱。

2.2.3 与正丁醇直接萃取产物含量的比较 取上样液20mL，用等体积水饱和正丁醇萃取三次[20]，合并萃取液，真空旋转蒸发除去溶剂，用去离子水复溶萃取物，干燥箱烘干称重，甲醇复溶后，测定皂苷含量，计算皂苷含量。

表2 树脂纯化法与正丁醇萃取法含量比较Table 2 Comparison of resin purifying method and butanol extraction method

由表2可以看出，提取液直接上大孔树脂纯化，比常用的正丁醇萃取所得含量高出一倍以上。

2.3 亚硝酸盐清除活性

亚硝酸盐可使血液的载氧能力下降，从而导致高铁血红蛋白症，还可与次级胺结合形成亚硝胺，从而诱发消化系统癌变，也会引起多种器官的恶性肿瘤。正常情况下，直接从食物中摄入的亚硝胺极少，但形成亚硝胺的前体物质亚硝酸盐却大量存在于食物中，亚硝酸盐与仲胺在人和动物体内均能合成亚硝胺，因此，清除体内亚硝酸盐是防癌的有效途径之一。

如图11可知，文冠果种仁脱脂粉提取液纯化物对亚硝酸盐有较强的清除作用，在5mg/mL时清除率可达60%，IC50值在3mg/mL。而纯化物较原提取物的清除活性增加3倍，与纯化倍数对应，表明是皂苷类物质对清除亚硝酸离子起作用。

图11 提取物对清除亚硝酸盐活性效果Fig.11 Nitrite scavenging ratios of extract at various concentrations

3 结论

3.1 由8种常用于皂苷纯化的树脂AB-8、ADS-7、860021、HPD-400A、NKA、HPD-722、D101、HPD-100中筛选出ADS-7树脂，对于文冠果皂苷吸附能力好，选择性高，适合于文冠果皂苷的纯化。该皂苷在ADS-7树脂上平衡时间为1h，上样液pH为4.5，吸附能力最强。

3.2 动态吸附解吸过程中，在提取液皂苷浓度为0.6mg/mL下，吸附和解吸上样流速均确定为4BV/h，洗脱时，先用2BV的去离子水，然后用3BV的70%乙醇溶液洗脱，再用2BV的90%乙醇解吸，解吸率达95.8%，并且含量达到32.2%±2.2%，是纯化前的5.4倍，是正丁醇萃取的2.2倍。

3.3 实验还对提取液及纯化物做了初步的体外活性实验，证明文冠果种仁脱脂粉提取纯化物对亚硝酸盐有较强的清除作用，在5mg/mL时清除率可达60%以上，IC50值在3mg/mL左右，因此可以减少亚硝酸盐导致癌症的几率。而纯化物较原提取物的清除活性增加3倍左右，与纯化倍数对应，表明是皂苷类物质对清除亚硝酸离子起作用。

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