高效液相色谱法测定玉米浆干粉中维生素B6的含量

刘跃芹，赵雪松，吴 杰，王金枝，吴延东，于立梅

（1.玉米深加工国家工程研究中心，吉林长春130033；2.仲恺农业工程学院轻工与食品学院，广东广州510225）

玉米浆是玉米淀粉生产过程中的副产物，富含B族维生素[1-2]，玉米浆是生产抗生素、味精等发酵产品培养基的重要组成成分，由于其富含可溶性蛋白和多种游离氨基酸，是微生物发酵的良好氮源[3-5]。玉米浆干粉是由鲜玉米浆低温瞬间加热喷雾干燥而成，保持了玉米浆液的特性，而且便于储存，使其应用更加广泛，在饲料行业以及抗生素、维生素、酶制剂等发酵工业中有重要应用[6]。维生素B6又称吡哆素，是一种含吡哆醇、吡哆醛或吡哆胺的B族维生素，其以辅酶形式参与体内蛋白质代谢，具有重要的生理功能[7-9]。玉米浆中富含维生素B6，能够对玉米浆干粉中维生素B6的含量进行监控，有利于玉米浆干粉的更广泛应用。当前各个与医药食品相关的行业对玉米浆干粉的关注程度提高，而目前对玉米浆干粉中维生素B6的检测尚未见报道。

目前，国内外已有关于测定饲料和药品中维生素B6的报道，主要包括微生物法紫外分光光度法和高效液相色谱法，其中微生物法灵敏度高，但其对样品的前处理复杂，实验周期长，杂质干扰大。紫外分光光度法的灵敏度较低、样品的基质干扰大等缺点，影响其广泛应用。高效液相色谱法因其分离效率高、选择性好、灵敏度高、分析速度快和自动化程度强等优点，逐渐成为维生素B6分析的首选方法。本文采用高效液相色谱法对玉米浆干粉中维生素B6进行了测定，建立了简单、快速、准确的定量方法，对玉米浆干粉在生产中能够更好地应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

维生素B6标准品 上海源叶生物科技有限公司，批号20120322；玉米浆干粉 法国罗盖特公司产品；乙二胺四乙酸二钠、盐酸 均为分析纯；庚烷磺酸钠 优级纯；三乙胺和甲醇 色谱纯；水 超纯水。

2695型高效液相色谱仪、2414型可变波长型紫外检测器 美国Waters公司；Milli-Q Gradient A10型超纯水系统 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品溶液的配制 精密称取适量维生素B6标准品于棕色容量瓶中，用0.1mol/L的盐酸水溶液溶解至刻度，配成1mg/mL的储备液。精密量取储备液适量，用0.1mol/L的盐酸水溶液稀释至所需浓度，浓度分别为0.10、2.00、5.00、8.00、10.00、20.00、50.00、100.00μg/mL，避光保存于4℃冰箱。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取5g玉米浆干粉于100mL棕色容量瓶，加入三分之二体积的盐酸水溶液（0.1mol/L），超声提取30min，中间旋摇一次，待温度降低至室温后，用盐酸水溶液稀释至刻度，过滤，取1.5mL清澈溶液过0.2μm滤膜，待测。整个操作过程需要注意避光，以避免维生素B6的光分解。

1.2.3 标准曲线的绘制 将标准系列溶液浓度为0.10、2.00、5.00、8.00、10.00、20.00、50.00、100.00μg/mL的维生素B6标准品进行HPLC析，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积为纵坐标，用加权（W=1/x2）最小二乘法进行回归运算[10]，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

1.2.4 准确度和精密度的考察 按1.2.1操作，分别制备低、中、高三个浓度（2.00、10.00、50.00μg/mL）的质量控制（QC）样品，每浓度6样本，连续测定三天。根据当日的工作曲线，计算QC样品的测得浓度，根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度。

1.2.5 提前回收率的考察 取玉米浆干粉样品，分别加入低、中、高三个浓度的维生素B6标准品，制备浓度分别为2.00、10.00、50.00μg/mL的溶液，然后按1.2.2操作，每浓度四样本；同时另取玉米浆干粉溶液，按1.2.2操作后，加入维生素B6标准溶液，配制成浓度为2.00、10.00、50.00μg/mL，涡旋混合，进行HPLC分析，获得相应峰面积，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率，提取回收率=A1/A2×100。

1.2.6 样品中维生素B6的测定 按1.2.2操作，制备三个平行样品，每个分析批（一天内测试的同种样品）制备一条工作曲线，进行HPLC分析，根据峰面积进行定量计算。

1.2.7 色谱条件 色谱柱为Symmetry-C18柱（3.9mm×150mm，5μm）；流动相：A相为甲醇，B相为含0.05g/L EDTA和1.1g/L庚烷磺酸钠的2.5%乙酸溶液（pH3.40），以A∶B为1∶6比例等度洗脱；流速为0.8mL/min；柱温为30℃；检测波长为280nm；进样体积为10μL；样品分析时间为10min。

2 结果与分析

2.1 分析方法确证结果

2.1.1 标准曲线 测定维生素B6的典型标准曲线见图1，其标准曲线方程为y=19509.8501x+2246.8396（r=0.9999），线性范围为0.10～100.00μg/mL。

图1 赤霞珠葡萄产地判别函数图Fig.1 Plot of discriminant functions

2.1.2 准确度和精密度 维生素B6的准确度和精密度的测定结果见表1，日间和日内精密度均小于15%，符合相关规范要求[8]。

表1 准确度与精密度实验（n=6）Table 1 Accuracy and precision of the measured results

2.1.3 提取回收率 维生素B6的低、中、高三个浓度回收率结果参见表2。三种浓度下玉米浆干粉样品中维生素B6的提取回收率分别平均为93.66%±1.38%、95.60%±2.77%、93.52%±2.46%。

表2 提取回收率实验（n=4）Table 2 Recoveries of the measured results（n=4）

2.2 样品测定结果

维生素B6标准品色谱图和样品色谱图见图2，测得玉米浆干粉中维生素B6的含量见表3，玉米浆干粉中维生素B6的平均含量为40.91mg/kg。

3 讨论

采用紫外-可见分光光度法对玉米浆干粉样品进行测定，由于杂质干扰严重，无法准确测定，而高效液相色谱法可以将样品中维生素B6的色谱峰与其他基质峰进行有效分离，且峰形良好，可以对玉米浆干粉中维生素B6进行精确定量。维生素B6色谱峰的保留时间为4.0min，维生素B6可在10min内与其他杂质峰分离，本法可以达到快速检测的目的。玉米浆干粉样品前处理简单，维生素B6是水溶性维生素，在酸液中稳定，本法采用0.1mol/L的盐酸水溶液进行提取，前处理操作步骤少，经济快速，稳定可靠，适用于维生素B6的快速测定。

图2 维生素B6的标准品和样品的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of vitamin B6 standard and sample

表3 玉米浆干粉中维生素B6的测定结果（n=3）Table 3 Recoveries of the measured results（n=3）

4 结论

本实验建立了高效液相色谱法测定玉米浆干粉中维生素B6的检测方法。确定了色谱条件：色谱柱为Symmetry-C18柱（3.9mm×150mm，5μm）；流动相：A相为甲醇，B相为含0.05g/L EDTA和1.1g/L庚烷磺酸钠的2.5%乙酸溶液（pH3.40），以A∶B为1∶6比例等度洗脱；流速为0.8mL/min；柱温为30℃；检测波长为280nm；进样体积为10μL；样品分析时间为10min。结果显示，维生素B6的线性范围为0.10～100.00μg/mL（r=0.9999），日间和日内精密度均小于15%，回收率较好。此法操作简便、快速、准确，可作为玉米浆干粉中维生素B6含量的检测方法，为玉米浆干粉的质量控制提供了可靠的分析检测方法。

[1] Xiao X，Hou Y Y，Liu Y，et al. Classification and analysis of corn steep liquor by UPLC/Q-TOF MS and HPLC[J]. Talanta，2013，107（30）：344-348.

[2] Sharmaa N，Prasadb G S，Choudhury A R. Utilization of corn steep liquor for biosynthesis of pullulan，an important exopolysaccharide[J]. Carbohydrate Polymers，2013，93（1）：95-101.

[3] Kall M A. Determination of total vitamin B6in foods by isocratic HPLC：a comparison with microbiological analysis[J].Food Chemistry，2003，82（2）：315-327.

[4] 李坤朋，许雅洁，赵锦芳，等. 大肠杆菌工程菌利用玉米浆发酵产L-乳酸的研究[J]. 中国酿造，2012，31（12）：64-66.

[5] 李文友，赵学明. 玉米浆为有机氮源的L-乳酸发酵的研究[J]. 化工时刊，2006（9）：64-66.

[6] 潘微，熊莲，彭万峰，等. 玉米浆干粉在葡萄糖和木糖混合丙酮丁醇发酵中的应用[J]. 化工进展，2011（12）：130-134.

[7] 王旭，任琳，邹晓莉，等. 同时测定保健食品中褪黑素和维生素B6的高效液相色谱方法研究[J]. 现代预防医学，2012，39（23）：6245-6250.

[8] 冯国. HPLC法测定复方吡拉西坦脑蛋白水解物片中维生素B1、B2和B6含量[J]. 中国药师，2013，16（6）：835-837.

[9] 邱洪，王宝佳，林芳，等. 复方四环素片中维生素B1和维生素B6的含量测定[J]. 中国药业，2009，18（1）：25-26 .

[10] 钟大放. 以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题[J]. 药物分析杂志，1996，16：343-346.