肿瘤坏死因子α在SD大鼠分泌性中耳炎动物模型中的表达

唐桥斐

沈阳医学院沈洲医院耳鼻喉科，辽宁沈阳 110002

1 材料与方法

1.1 大鼠SOM模型建立

实验动物分组：入选标准：入选动物需满足以下条件：鼓室压≥-50 Dapa（1 Dapa=0.0098 Kpa，正常声阻抗图为A型曲线）；依次标准检查后，8只SD大鼠被淘汰，2只不明原因死亡。70只SD大鼠分为3组。①实验组：即造模组，30只，右侧中耳腔内注射ET 35 μL；②对照组：30只，健康，双耳未经处置。③生理盐水（NS）组：10只，右侧中耳腔内注射NS 35 μL；两组左耳均作为正常对照。

动物处死及标本采集：实验组术后6 h、1 d、7 d、3 d、14 d、对照组及NS组分别取了6只、5只动物深麻醉后先行心内穿刺抽取血液0.5 mL，立即离心（3000 r/min）取上清液。断头并且暴露右侧听泡，找到穿孔部位用50 μL微量加样器抽取中耳积液后，以25 μL NS冲洗听泡3 次，将冲洗液与中耳渗液一起收集，并离心取上清液。将血液与中耳渗液标本离心后的上清液于- 80 ℃冻存待检。

1.2 免疫组化染色

主要试剂为兔抗大鼠TNF-α多克隆抗体及相应的SP试剂盒。采用免疫组化SP，染色方法，步骤按说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照，以排除非特异性染色。采用HAPIAS1000 彩色多媒体图像分析系统对标本切片的免疫组化染色结果进行图像定量分析。

以TNF-α在中耳黏膜上皮细胞及血管内皮细胞中的平均灰度值作为观察指标。以细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒为TNF-α阳性细胞。进行图像定量分析的时候，在400倍视野下选取不相重叠的5个代表性的部位，测量上皮阳性细胞和血管内的皮阳性细胞的灰度值，取它的均值为该标本的测量结果。

1.3 ELISA方法检测大鼠SOM模型各组TNF-α总蛋白含量

试剂和仪器：TNF-α ELISA检测试剂盒，DG 3302酶联免疫检测仪。标本的检测：按照试剂盒提供的检测方法开始进行操作，绘制标准的曲线。根据标准的曲线各点来进行回归分析，从而得出回归的方程Y=a+b……X (r=……，标准曲线在××～×× 106pg/mL的范围内回归系数为0.××，符合上述回归方程)，将样品的OD 值代入公式并求出样品中的TNF-α含量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 11.0软件包进行分析，计量资料：统计描述：用（±s）；统计分析：成组数据的平均值比较，如方差齐用t检验，如方差不齐用t＇-检验；配对数据的平均值比较，用配对t-检验；多组间比较采用F-检验及两两比较q-检验。计数资料：统计描述：用百分率；统计分析：用χ2-检验；相关资料：采用直线相关分析法；TNF-α和TNF soLRⅡ浓度统计，运用Mikrowin软件4参数回归法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 普通病理染色观察鼓室黏膜形态

①在ET组术之后，6 h中的耳黏膜上皮下间隙增厚，1 d时增厚更著并见炎性细胞浸润，中耳腔可见炎性细胞渗出，主要是多形核中性的白细胞。3 d时上述改变达高峰。7 d只见上皮下间隙增厚，并且明显有所减轻。14 d时基本上已经恢复正常。②NS组未见明显的异常变化。

2.2 免疫组化染色观察结果

TNF-α在内毒素注入6 h开始表达，随后逐渐增高，于3 d时达高峰，经统计学分析，1 d、3 d、7 d组与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），1 d与3 d，7 d与3 d组相比都有一定的意义（P＜0.05），14 d 、6 h组与正常组相之比较，没有明显性的差别。

2.3 ELISA方法检测结果

TNF-α在内毒素注入6 h时可以检测，随后蛋白含量逐渐增高，于3 d时达高峰。经统计学分析，1 d、3 d、7 d组与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），1 d与3 d，7 d与3 d组分别比较均有统计学意义（P＜0.05），6 h、14 d组与正常组比较无显著性差异。

3 讨论

分泌性中耳炎是耳鼻喉科的常见病、多发病，一年四季、成年人及儿童均可发病，以中耳腔出现渗出液为主要特征。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是CK中倍受人们关注的一种因子，它是机体炎症反应和免疫应答的重要调节因子。它的生物学活性包括了激活炎性细胞，加强WBC向炎症局部渗出。

[1]李莹.TNF-α与CD44在SD大鼠分泌性中耳炎的表达及意义[D].泸州医学院，2011.

[2]李希平，赵守琴.肿瘤坏死因子-α在分泌性中耳炎动物模型中的表达[J].中国医学文摘（耳鼻咽喉科学）.2006（1）.