SHIP及其相关信号通路与炎症性肠病

蒋巍亮 综述 郑 萍 审校

上海交通大学附属第一人民医院消化科1(200080) 同济大学附属东方医院消化医学部2

人类 SHIP［Src homology 2(SH2)domain-containing inositol 5’-phosphatase］蛋白为肌醇磷酸酶家族成员之一，主要表达于造血细胞中，在造血细胞的生长、分化和功能发挥方面起关键性负向调控作用，可抑制细胞增殖和存活，过度表达时可引起细胞凋亡增加。炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因尚不十分清楚的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。近年国内外研究发现SHIP可能在IBD的发病中发挥不容忽视的作用，为IBD治疗靶点的选择提供了一种新思路。本文就SHIP及其相关信号通路与IBD的关系作一综述，并展望SHIP在IBD中可能的临床意义。

一、SHIP的基本结构和生物学功能

1996年，Damen等［1］应用多种细胞因子刺激鼠类造血细胞后，首次发现了一种新的酪氨酸磷酸化蛋白——SHIP。人类SHIP蛋白由定位于染色体2q37.1的INPP5D基因编码，是一种含Src同源序列2(SH2)结构域的肌醇5’-磷酸酶，包括SHIP1、sSHIP、SHIP2等成员。通常所称的SHIP系指最常见的SHIP1。SHIP1相对分子质量为145 kDa(1 Da=0.9921 u)，由1188个氨基酸组成，仅表达于血细胞，如淋巴细胞、粒细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞、血小板等［2，3］。

位于氨基末端的SH2结构域是SHIP蛋白的特征性结构域，对生长因子介导的蛋白/蛋白相互作用具有重要意义，可特异性地识别、结合蛋白质分子中的磷酸化酪氨酸残基。SHIP蛋白中部由400～500个氨基酸组成的序列构成具有去磷酸化作用的肌醇5’-磷酸酶活性区域，可使肌醇多磷酸盐的5’位磷酸发生水解。位于羧基末端的两个NPXY单元在发生酪氨酸磷酸化后与衔接蛋白SH2携带蛋白(Shc)的磷酸酪氨酸结合域以及磷脂酰肌醇(PI)3-激酶(PI3K)p85亚基的SH2结构域相互作用。此外，SHIP蛋白羧基末端还存在数个富含脯氨酸的区域(proline rich region)，其中一个是衔接蛋白生长因子受体结合蛋白2(Grb2)SH3结构域的结合位点。作为一种信号蛋白，SHIP的功能由其结构特征和酶活性决定［1，3，4］。

二、SHIP相关信号通路及其作用

SHIP可在多种细胞因子、生长因子的刺激下发生酪氨酸磷酸化，参与这些因子介导的信号转导通路。SHIP能与衔接蛋白Shc和Grb2结合，提示其为与c-fms/CSF-1通路相关的磷酸酶。B细胞和肥大细胞上的SHIP能被抑制性IgG受体FcγRⅡB激活，证实其为细胞内信号转导抑制分子。FcγRⅡB胞质部分的免疫受体酪氨酸相关抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)磷酸化后能募集SHIP于胞膜，SHIP通过抑制含血小板-白细胞C激酶底物同源序列(pleckstrin homology)结构域蛋白的募集，阻止细胞外钙离子内流，从而抑制细胞因子转录激活和释放［5，6］。此外，SHIP尚能调控淋巴细胞、骨髓细胞中的多种细胞因子相关以及抗原、抗体相关信号通路。SHIP能否在细胞信号转导中发挥作用取决于以下三点:①细胞是否表达以及以何种水平表达SHIP;②SHIP须从胞质被募集至胞膜，方能发挥其去磷酸化作用;③SHIP的酶活性区域需要变构激活［7］。

PI3K信号级联是一条关键性的细胞内信号转导通路，参与调控细胞的存活、黏附、迁移、代谢活性、增殖、分化、激活等大量生物学过程，对免疫系统功能的调控亦具有重要意义。PI3K接受各种生长信号的刺激被激活后，催化PI-4，5-二磷酸盐(PI-4，5-P2)生成 PI-3，4，5-三磷酸盐(PI-3，4，5-P3，PIP3)，PIP3作为第二信使激活下游信号分子Akt，Akt通过NF-κB 抑制蛋白激酶 α(IKKα)活化 NF-κB［3］。PI3K-PIP3-Akt-NF-κB信号通路在细胞存活和凋亡过程中发挥重要调控作用，与炎症、自身免疫介导的病变以及肿瘤发生、发展等密切相关。而位于SHIP蛋白中部的肌醇5’-磷酸酶活性区域能特异性地催化PI肌醇环上的5’位磷酸发生脱磷酸化反应，使PIP3水解为PI-3，4-P2。SHIP通过此种酶催化作用下调生长信号诱导的PI3K依赖性Akt激活，负向调控PI3KAkt信号通路，进而抑制下游NF-κB等信号分子活化。目前国内外对SHIP的认识主要集中在血液病领域，关于其在包括IBD在内的自身免疫性和炎症性疾病中的表达及其意义仍处于探索阶段，尚未形成系统性认识。下文将着重概述SHIP及其相关信号通路在IBD中的表达和意义。

三、SHIP与IBD

IBD是一种病因不明的慢性非特异性自身免疫性疾病，目前观点认为肠道微生物在IBD的发病中起重要作用［8］。肠道微生物(主要是革兰阴性杆菌)细胞壁中所含的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)在细菌死亡或破坏后被释放，对肠黏膜造成损伤，故亦称为内毒素，其主要毒性成分为类脂质A。大量研究证实LPS的刺激是触发IBD相关炎症通路的起始信号。LPS被肠上皮细胞、树突细胞、巨噬细胞表面的Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)识别并结合后，炎症通路即正式启动［9，10］。在肠道炎症反应中处于中心地位的巨噬细胞激活后分泌大量炎症因子和生物活性物质，在促进和维持炎症反应中起重要作用。活动期IBD患者肠黏膜巨噬细胞明显增加［11］，映证了其与IBD发病有密切联系。

肠道细菌胞壁LPS释放后，与可溶性LPS结合蛋白(LBP)结合形成复合体，被细胞表面的CD14分子(广泛表达于单核巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞表面)识别并结合，其后CD14将LPS/LBP复合体呈递至TLR4并导致其构象发生改变。跨膜蛋白TLR4激活后，其胞质部分开始聚集多种衔接蛋白，包括MyD88、TIRAP、TICAM-1。之后的信号转导分为两条通路，分别为MyD88依赖性和非依赖性通路。MyD88依赖性通路即MyD88与TIRAP共同激活下游IRAK家族，主要是IRAK-1和IRAK-4，引起其自身磷酸化;磷酸化的 IRAK脱离TLR4复合体，结合并激活下游TRAF6;至此，肠道炎症级联信号通路得以启动，p38 MAPK、ERK、c-Jun、AP1逐级激活，最后活化的 NF-κB进入细胞核，与特异性κB序列结合，诱导相关炎症因子基因如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)等转录，继而大量合成、释放。MyD88非依赖性通路即 TICAM-1通过 TBK-1、IKKε激活AP1和NF-κB。值得注意的是，MyD88非依赖性通路可通过转录因子——干扰素调节因子3(IRF3)上调干扰素-β(IFN-β)表达，后者以自分泌方式通过胞膜受体激活另一条重要炎症通路——JAK/STAT1通路，在诱导生成诱生型一氧化氮合酶(iNOS)以及NO的同时，协同NF-κB通路促进炎症发展［10，12］。

与此同时，在受LPS刺激的免疫细胞中，PI3K亦得以激活(通过与MyD88或IRAK-1相互作用)。研究［13］发现在小鼠巨噬细胞中，LPS刺激可通过TLR4使PI3K与MyD88形成复合体，进而选择性诱导下游细胞因子产生。无论PI3K以何种方式活化，PI3K-Akt-NF-κB信号通路对于炎症因子、NO等的产生都是必需的。因此，SHIP对该信号通路活性的抑制作用在细胞生理活动过程中具有重要意义。实验证明SHIP－/－骨髓源性巨噬细胞和肥大细胞由LPS刺激产生的TNF-α、IL-6、IL-1β、NO 浓度明显高于 SHIP+/+细胞，证实SHIP 对 PI3K-Akt-NF-κB 信号通路具有抑制作用［2］。NOD2在细菌感染时促炎反应和抗微生物应答的激活中起重要作用，是最早被发现的CD易感基因。研究［14］显示SHIP－/－巨噬细胞中NOD2、NF-κB活化增强，由LPS刺激产生的TNF-α、IFN-γ等的浓度明显高于 SHIP+/+细胞，表明 SHIP对NOD2-NF-κB信号通路同样具有抑制作用。

人类肠道黏膜对细菌内毒素的损伤作用存在下述保护机制:巨噬细胞初次受小剂量LPS刺激后，会出现短暂不应期(2～3周)，在这段时间内，即使再度受大剂量LPS刺激，产生的炎症因子、NO亦大幅减少，该现象称为内毒素耐受(endotoxin tolerance)。内毒素耐受可使宿主免于巨噬细胞或其他免疫细胞过度活化所致的损伤，并使免疫细胞适应持续性细菌感染。体外实验发现SHIP－/－骨髓源性巨噬细胞和肥大细胞不存在内毒素耐受现象，而相应野生型细胞初次受LPS刺激后，SHIP水平明显增高，且经证实为内毒素耐受的发生所必须;应用SHIP－/－和SHIP+/+小鼠模型的动物实验证实了上述发现，并显示SHIP水平增高与内毒素耐受时间相关［15］。该研究结果表明SHIP在肠道微生态平衡的维持中起重要作用。

巨噬细胞和肥大细胞初次受LPS刺激而激活后，产生大量具有自分泌作用的细胞因子如转化生长因子-β(TGF-β)、IL-10、IFN-β［2，16］，三者均可使细胞内 SHIP 表达上调，从而参与内毒素耐受。尽管TGF-β、IL-10、IFN-β的作用机制可能各不相同，但三者极有可能协同促进SHIP激活，从而负向调控巨噬细胞以及其他免疫细胞功能，减轻其再次暴露于LPS刺激时产生的炎症应答，下调促炎细胞因子的产生和释放，甚至可能诱导抗炎细胞因子产生和释放［2］。

Arijs等［17］观察了SHIP在IBD患者肠道中的表达，发现UC和CD肠黏膜的SHIP表达明显高于正常对照者，但CD时SHIP仅在结肠中表达增高，回肠表达正常。鉴于SHIP mRNA表达与调节性 T细胞(Treg细胞)标记物 FOXP3 mRNA表达呈显著正相关，推测其机制可能与Treg细胞的作用有关。Kerr等［18］发现SHIP缺陷小鼠发生典型CD样回肠炎伴肠壁纤维化，肠黏膜中性粒细胞数量明显增多，大量多形核白细胞浸润末端回肠固有层，引起黏膜损伤;移植野生型小鼠骨髓的 SHIP－/－小鼠回肠炎明显减轻，证明SHIP在肠道免疫中起关键作用，可抑制粒细胞在外周组织过度增殖。SHIP缺陷小鼠的回肠炎可能与局部黏膜T细胞免疫不足有关，SHIP缺陷导致小肠黏膜局部CD4、CD8 T细胞数量明显减少，但Treg细胞数量不变，使粒-单核细胞对肠腔抗原产生异常免疫应答，发生粒-单核细胞炎症。值得注意的是，此种CD样病变仅局限于末端回肠而不累及结肠。两项研究中CD患者回肠SHIP表达正常以及SHIP缺陷可致小鼠回肠炎的结果或许并不是一种巧合，其间的联系有待进一步研究。

传统观点认为巨噬细胞活化在IBD病程中起不可或缺的作用，但近年研究发现该结论必须建立在巨噬细胞系以经典方式活化的基础之上，此类巨噬细胞称为M1型巨噬细胞。然而，越来越多的实验证据表明巨噬细胞尚可经由替代途径活化为M2型巨噬细胞，后者的作用为减少NO等因子释放，减轻炎症反应。有学者指出，由于SHIP－/－小鼠骨髓祖细胞PIP3水平长期增高，其巨噬细胞倾向于活化为M2型［19］。Weisser等［20］以葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠肠道炎症，发现SHIP－/－小鼠的炎症程度明显轻于野生型小鼠，表现为直肠出血延迟以及肠道结构破坏和免疫细胞浸润减轻等，且证实该保护作用系由巨噬细胞所介导，证实SHIP缺陷可使小鼠体内的巨噬细胞经由替代途径活化为M2型，M2型巨噬细胞对肠道炎症起保护作用。该研究结果与Kerr等［18］研究结果的矛盾之处在于，SHIP－/－小鼠易患CD样回肠炎，却对DSS诱导的结肠炎症产生抵抗，相关机制有待进一步探讨。

PI3K通路虽已被证实在IBD的发病中起关键作用，但关于其确切作用，各文献报道却大相径庭。Aman等［21］的研究显示SHIP可水解PIP3产生PI-3，4-P2以抑制Akt活性，从而负向调控PI3K-PIP3-Akt-NF-κB信号通路，抑制炎症因子基因转录。Franke等［22］却发现 SHIP水解 PIP3产生的PI-3，4-P2可通过与Akt的血小板-白细胞C激酶底物结构域相互作用而激活下游Akt，其作用甚至强于PIP3。因此，SHIP在IBD中的作用究竟是抑制PIP3-Akt通路从而抑制炎症，还是激活PIP2-Akt通路从而促进炎症，尚待深入研究。Imielinski等［23］在研究 IBD易感基因位点时，发现2q37位点——即SHIP基因位点多态性与IBD早期发病显著相关。这一证据有力支持SHIP参与了IBD的发病，并在其中起重要作用。

四、结语和展望

目前临床上IBD的治疗手段仍以传统5-氨基水杨酸制剂、糖皮质激素制剂和免疫抑制剂为主，但存在疗效不理想或长期使用不良反应较严重等问题，新型生物制剂价格昂贵，多数患者难以承受。因此，寻找新的经济、有效的IBD治疗药物成为研究者关注的热点。2012年，Blunt和Ward提出了一个全新的观点:以PI3K抑制剂治疗炎症和自身免疫性疾病［24］。SHIP为PI3K信号通路的有效调控因子，且局限性表达于造血细胞，故引导以SHIP为靶点的药物在免疫系统内发挥作用是一种可行的方法，SHIP有望成为理想的IBD治疗靶点。相信围绕SHIP的研究及其发现将引领我们从全新的角度重新审视IBD的治疗。

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