非酒精性脂肪肝动物模型研究进展

李强 傅继华

（1 中国药科大学2010 级药理学硕士研究生 江苏南京210009；2 中国药科大学生理教研室 江苏南京210009）

非酒精性脂肪肝 (Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史，但病理学改变类似酒精性脂肪性肝病，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征[1]。近年来随着人民生活水平的提高，高热量的饮食习惯和不良的生活方式使得肥胖、高脂血症、糖尿病及由此引起的NAFLD 的发病率有明显上升的趋势。虽然脂肪肝被认为是良性病变，但它是许多慢性肝脏疾病的早期阶段。

1 NAFLD 的发病机制

“二次打击”学说是Day 等在1998 年提出的[2]，目前已被广泛接受。一次打击主要是胰岛素抵抗导致肝细胞脂肪变性，形成单纯性脂肪肝。二次打击因素通过增强脂质过氧化反应和(或)刺激Kupfer 细胞释放炎性介质，引起脂肪变性的肝细胞发生气球样变和点状坏死，同时吸引中性粒细胞和淋巴细胞趋化至肝小叶内，形成脂肪性肝炎。并在此基础上促进肝星状细胞激活、转化和合成细胞外基质，从而诱发进展性肝纤维化。

2 NAFLD 的动物模型研究

目前对脂肪肝的防治研究日益成为医学关注和研究的焦点，建立不同方法不同因素诱发的脂肪肝动物模型对脂肪肝的发病机制研究和药物治疗开发尤为重要。NAFLD 动物模型采用的实验动物主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家兔、家鸭、小型猪等，但以大鼠造模最为常见。本文重点围绕大鼠NAFLD模型的研究进展进行综述。

2.1 营养失调性脂肪肝模型 此类模型是通过12周以上的高脂肪、高胆固醇和/或高糖高淀粉饲料喂养诱发的非酒性脂肪肝模型。成模标准是造模组相对于对照组，血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol, TC)、游离脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA) 和低密度脂蛋白 (Low Density Lipoprotein,LDL)等水平显著升高；肝脏TC、TG 和FFA 等水平显著升高；肝细胞明显水肿，胞浆内出现大小不等的脂滴，呈肝细胞脂肪变性，偶见肝细胞点状坏死或炎症等。

2.1.1 高脂饲料诱发脂肪肝模型 高脂饮食诱导的NAFLD 模型在发病机制上与人类NAFLD 最相似，且多合并肥胖、胰岛素抵抗及其他代谢综合征的组分。高脂饮食构造原理基本一致(增加游离脂肪酸的摄取或合成)，主要差别在于饮食中脂肪比例不等(10%～71%)，含或不含高碳水化合物。有研究表明脂肪含量占28%以上的饮食可使动物出现肥胖[3]。在普通饲料中添加猪油或花生油等高脂肪含量物质，可促进过氧化反应发生，产生自由基和醛类物质，醛类物质可与抗氧化剂的活性部位结合，减少自由基的清除，加速NAFLD 的形成。Aragno 等[4]采用普通饲料添加15%猪油和4%胆固醇饲养大鼠15 周，生化指标显示模型组大鼠体重、肝指数、肝脏TG、TC、FFA、LDL 水平均显著高于对照组，肝脏病理学切片显示模型组大鼠肝脏脂肪沉积明显增加。高思源等[5]采用高脂饲料喂养大鼠并结合慢性应激，12 周后发现肝脏水溶性总胆固醇、三酰甘油含量明显升高，肝脏LXRα、PPARγ mRNA 表达进一步下调，血皮质醇浓度升高，用此方法建立NAFLD 模型的过程可能更接近于人类NAFLD 病人的发病过程。高脂饲料诱发脂肪肝模型所用饲料的营养结构与西方人群的饮食结构类似，都是以动物脂肪为主要的能量来源，可以作为模拟西方人群脂肪肝疾病的动物模型。

2.1.2 高碳水化合物诱发脂肪肝模型 在普通饲料中添加蔗糖或玉米粉等高糖高淀粉含量物质，可增加长链脂肪酸的合成而使TG 的合成增加，并且当血糖升高时，NADPH 供应充分，使乙酰辅酶A 转变成的胆固醇增加。在Wistar 大鼠的饮用水中加入10%蔗糖，48 h 内即能在其体内观察到脂肪酸合成增加。SD 大鼠经含糖量极高(蔗糖70%)的饮食喂养后出现肥胖，2～3 周可形成脂肪肝，伴参与脂肪合成的酶类及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成增加[6]。Fu等[7]采用普通饲料添加15%玉米粉和3%胆固醇饲养大鼠12 周，生化指标显示模型组大鼠肝脏TC、TG 水平，血清TC、TG 和LDL 水平显著高于对照组。肝脏病理学切片显示模型组大鼠肝细胞内出现大泡性和小泡性脂肪变性。该模型所用饲料的营养结构与东方人群的饮食结构类似，都是以糖类为主要的能量来源，可以作为模拟东方人群脂肪肝疾病的动物模型。

上述两种模型操作方法简便，价格低廉，重复性好，实验动物死亡率低，对实验人员无毒，病变过程与人类脂肪肝形成过程类似，病变后逆转缓慢适合药物干预治疗，是国内外常用的脂肪肝模型。但是造模时间长，实验动物易产生厌食、腹泻等不良反应。

2.1.3 胆碱-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline Deficiency， MCD)饮食脂肪肝模型 MCD 饮食脂肪肝模型是由美国Harlan Teklad 实验室开创[8]。胆碱又称为VitB4，是卵磷脂、乙酰胆碱等物质的组成成分。当缺少胆碱时，肝脏合成磷脂减少，不能有效地合成脂蛋白, 特别是极低密度脂蛋白(VLDL)；而VLDL 是运输内源性甘油三酯出肝的主要形式，从而使甘油三酯在肝脏内积聚，迅速沉积，形成脂肪肝。积累在肝的甘油三酯代谢生成甘油二酯，胆碱与甘油二酯生成卵磷脂减少会导致甘油二酯积累，结果细胞膜中的卵磷脂会被代谢以提供胆碱，引起肝细胞膜损伤[9]。MCD 饮食喂养的啮齿类动物，肝组织出现腺泡3 区严重脂肪变，随后见到以淋巴细胞和多形核白细胞浸润为主的坏死性炎症，进一步发展形成细胞周围及中央静脉周围纤维化[10]。George 等[11]采用MCD 饮食饲养大鼠17 周，肝脏病理学切片显示模型组大鼠肝脏2 周后出现轻微脂肪变性，5 周后出现大泡性脂肪变性、炎症细胞浸润和肝小叶病变。该模型是经典的非酒精性脂肪性肝炎动物模型，操作方法简便，造模时间短，应用极为广泛。但是MCD 饲料价格昂贵，且人类肝脏不含胆碱氧化酶，不存在胆碱缺乏问题，所以该模型的发病机制与人类完全不同，它最大的缺点是缺乏人类NAFLD 所具有的胰岛素抵抗。目前，该模型主要用于脂肪肝治疗药物的筛选，并可为非肥胖而伴NAFLD 等特殊脂肪营养障碍疾病提供研究思路。2.1.4 全肠外营养(TotalParenteralNutrition,TPN) 脂肪肝模型 TPN 是由宾夕法尼亚大学的Dudrick 在1968 年首次临床报道[12]，成年Wistar 大鼠深静脉插管，电脑输液泵将营养液以3 mL/h 的速度持续滴注，当肠外营养液中非蛋白能量达到33%以上或总摄入量占总热量83%以上时，1 周后大鼠肝脏即出现明显的脂肪变性，主要是由于甘油三酯积聚所致，此外，尚存在血清VLDL 明显降低，提示肝脏分泌甘油三脂受抑。Ling 等[13]采用TPN 造模4 d，生化指标显示模型组大鼠血清C- 反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP) 和肝脏TG 水平均显著高于对照组，血清TG 水平显著低于对照组。该模型造模时间短，形成率高，但是由于操作方法复杂，限制了该模型的推广应用。

2.2 药物中毒性脂肪肝模型 药物或化合物作用引起肝脏脂肪变性，使肝细胞脂质成分的合成和(或)摄入增加，或释放和代谢减低，均能使脂肪在肝细胞内堆积，甚至常常为多种机制同时参与、协同促进脂肪变性的发生。以下两种模型操作方法简便，造模时间短，形成率高，但呈急性病变过程，与人类脂肪肝的发病机制和病理生理学改变有着本质的区别，由于药物具有较大的毒性，实验动物死亡率高，且对实验人员有一定的毒性。

2.2.1 四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)脂肪肝模型 CCl4是最早采用的实验性脂肪肝模型诱导剂。主要机制可能与CCl4诱导CYP2E1 激活及严重脂质过氧化反应造成肝细胞结构和功能破坏有关[14]。Fang 等[15]采用2 mL/kg CCl4灌胃，一周2次，持续8 周，生化指标显示模型组大鼠肝脏肿大率达185，TG、MDA 水平显著高于对照组。

2.2.2 乙硫氨酸脂肪肝模型 灌胃给予雄性Wistar大鼠乙硫氨酸0.25 g/kg，48 h 后血清三酰甘油、总胆固醇、脂蛋白减少，血清酶轻度升高，肝内三酰甘油含量明显升高，病理表现为肝细胞肥大，肝窦消失，肝细胞核旁胞浆空壳，部分形成明显脂滴，偶见炎性细胞浸润，无明显坏死及纤维化[16]。Furuhama等[17]在大鼠饮食中加入0.25%的DL-乙硫氨酸，持续2 周，生化指标显示模型组大鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT) 和总胆固醇含量显著升高，肝脏病理学切片显示模型组大鼠肝脏出现严重的脂质沉积和纤维化。

2.3 特殊品系脂肪肝模型 特殊品系脂肪肝大鼠是一类由人工选育的，可先天或自发形成脂肪肝，无需后天给药或调整饮食结构的动物模型。以下两种模型可用于并发代谢综合征的脂肪肝的研究，而不适用于后天营养失调所致脂肪肝的研究。特殊品系大鼠来源较为稀少，价格昂贵，且死亡率较高，仅适于特定病理机制的研究。

2.3.1 遗传性肥胖Zucker 大鼠 遗传性肥胖Zucker 大鼠是一种著名的并得到广泛应用的遗传性肥胖病模型，可发生高胰岛素血症、胰岛素抵抗而自发形成糖尿病、肥胖和脂肪肝。Flamment 等[18]证明遗传性肥胖Zucker 大鼠的体重、肝脏重量、肝脏TG 含量、血糖、胰岛素、瘦素、脂联素水平均明显高于普通Zucker 大鼠。

2.3.2 BHE 大鼠 BHE 大鼠是一种生后300 d 自发形成糖耐量异常，血糖、血脂显著升高，形成高脂血症、脂肪肝，但无肥胖的特殊种系[19]。该品系主要用于2 型糖尿病的研究，作为脂肪肝模型应用并不广泛。

3 NAFLD 模型研究展望

一个理想的动物模型符合以下标准：（1）发病特征与人类脂肪肝病变特征相似；（2）病变有一定发展过程；（3）形成率高，死亡率低，可控性强，重复性好；（4）造模方法简便易行，价格低廉。在上述几种非酒精性脂肪肝模型中，采用高脂饲料诱导的脂肪肝模型因其操作方法简便，价格低廉，重复性好，死亡率低，是国内外最常用的造模方法。但是由于人体机体功能的复杂性和实验动物种族差异性，以及动物年龄、饲料配方、造模时间以及模型判定指标等方面仍缺乏相对统一标准，使任何一种实验动物模型都不能全面模拟人类非酒精性脂肪肝的演变过程，无法准确地反映脂肪肝疾病的本质，难以满足所有脂肪肝疾病的科研需要，因此，建立一个能完全反映人类脂肪肝的动物模型比较困难。总之，不同造模方法所形成的脂肪肝模型在发病机制和病理改变等方面具有本质的差别，需根据实验研究目的的不同，选择符合人类脂肪肝形成过程及病变特征、造模时间短、动物死亡率低、重复性好、操作方法较简便的动物模型进行相关研究。

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