微波法提取玉米须抗痛风活性组分的工艺研究

郭兵兵，张 燕，赵文竹，于志鹏，安晓宁，刘静波，*

(1.吉林大学军需科技学院，吉林长春130062;2.吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春130022)

痛风(Gout)是长期嘌呤代谢障碍、血尿酸增高引起组织损伤的一组异质性疾病［1］。临床通常表现为急性关节炎反复发作、痛风石沉积、关节活动障碍和畸形;而且还容易累及肾脏和心血管系统，造成肾尿酸结石和痛风性肾实质性病变等［2］。目前，用于调节尿酸代谢和治疗急性痛风性关节炎的药物有别嘌呤醇、丙磺舒、苯溴马隆、秋水仙碱和糖皮质激素等。然而这些药物有许多副作用，如引起头痛、皮疹、水肿、胃肠出血、慢性肾乳头坏死及致死性超敏综合症等，从而在很大程度上限制了其在临床上的应用［3－5］。玉米须，俗称棒子毛，禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱头。含有多种营养成分:黄酮、多糖、氨基酸、生物碱、β－谷甾醇、维生素、无机盐等。研究表明玉米须黄酮类化合物可以抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)活性，从而降低体内尿酸水平，达到治疗痛风的目的［6］。日本学者Nguyen通过对288种越南药用植物提取物的XOD抑制率进行测定，证实有效成分中含有黄酮类化合物［7］。国内学者也证实玉米须提取物具有抗痛风活性［8－9］。本文采用二次回归正交旋转组合设计优化玉米须黄酮的微波萃取工艺，并综合考虑黄酮提取率以及酶抑制率两个指标，确定了玉米须抗痛风活性组分的最佳提取条件，为以后研究开发奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米须 吉林大学营养与功能食品研究室提供;芦丁、别嘌呤醇、黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤 美国Sigma公司;氢氧化钠、无水氯化铝、硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇 均为分析纯，北京化工厂。

MILIPORE牌超纯水机 美国;UV2550岛津紫外可见光分光光度计 岛津国际贸易有限公司;旋转蒸发仪、恒温水浴锅、循环水真空泵 巩义市英峪高科仪器厂;FW－200万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;MAS－Ⅱ微波萃取仪 上海新代微波化学科技有限公司;电热恒温培养箱 湖北省黄石市医疗器械厂;标准筛 绍兴海特仪器有限公司;METTLER TOLEDO XS205电子称 瑞士。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米须抗痛风活性物质的提取工艺流程 干燥的玉米须→粉碎→过40目筛→微波萃取→旋转蒸发浓缩→干燥→加醇溶解→定容→活性测定

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 微波功率单因素实验 取粉碎后的玉米须5.00g，用60%的乙醇按照液料比20∶1(mL/g)浸泡，60℃下，分别在微波功率为 400、500、600、700、900W条件下萃取20min。料液分离后，45℃下热风干燥。然后用30%的乙醇溶解，制备4mg·mL－1的待测液，按照1.2.5的方法测定黄酮提取率。再用去离子水将其稀释成3%乙醇溶解的浓度为200μg·mL－1的待测样液，按照1.2.4给出的方法测定其酶抑制率。黄酮提取率和酶抑制率按3∶7的权重计算提取总效果值。

1.2.2.2 微波时间单因素实验 取粉碎后的玉米须5.00g，用60%乙醇按照液料比20∶1(mL/g)浸泡，在微波温度60℃，微波功率600W条件下，分别萃取5、10、15、20、25min。以下操作同 1.2.2.1。

1.2.2.3 乙醇浓度单因素实验 取粉碎后的玉米须5.00g，分别用40%、50%、60%、70%、80%的乙醇按照液料比20∶1(mL/g)浸泡，然后控制微波温度60℃，微波功率为600W 萃取20min。以下操作同1.2.2.1。

1.2.2.4 液料比单因素实验 取粉碎后的玉米须5.00g，用 60%乙醇分别按照 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)液料比浸泡，然后在60℃，微波功率为600W条件下萃取20min。以下操作同1.2.2.1。

1.2.3 二次回归正交旋转组合设计方法 在单因素实验的基础上，选择合适的参数范围，对微波功率、微波时间、乙醇浓度以及液料比四个因素进行了二次回归正交旋转组合设计实验。实验自变量因素编码及水平见表1。

表1 二次回归正交旋转实验因素水平及编码表Table 1 Factors and levels coding of the orthogonal rotation test

1.2.4 抗通风活性测定

1.2.4.1 尿酸的最大吸收波长的检测 向黄嘌呤溶液中加入适量XOD，反应一段时间后在200～800nm下进行慢速扫描获得图谱。

图1 尿酸在200～400nm的扫描结果Fig.1 Result of scanning solution of uric acid at wavelength of 200～400nm

1.2.4.2 黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶产生尿酸的检测 向试管中加入 300μL 的提取液(200μL/mL)，210μL pH7.5的 PBS缓冲溶液，然后加入 180μL的0.01U/mL刚配制的黄嘌呤氧化酶［10］溶液，25℃下静置15min后，加入360μL 1.5mol/L的黄嘌呤溶液。混合均匀，25℃下反应 30min，加入 150mL 1mol/L HCl终止反应，290nm测定吸光度。先加入150μL的盐酸再加入XOD为空白对照。测定值与空白值之差为尿酸的吸光度。别嘌呤醇为阳性对照。

1.2.4.3 XOD活性的计算 XOD活性的计算采用抑制百分率来表示:

式中，A:用3%的乙醇溶液代替提取物样液，在290 nm条件下测定的吸收值;B:反应前后吸光度的差值。

所有测定值均为三次测定值的平均值。

总效果值(%)=(黄酮提取率×30%+酶抑制率×70%)×100

1.2.5 黄酮提取率测定［11］采用标准曲线法。称取干燥至恒重的芦丁标准品10mg，用30%的乙醇溶解，定容至25mL，摇匀得0.4mg/mL的芦丁标准溶液。分别取0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0mL 的 0.4mg/mL 芦丁标准溶液置于25mL的容量瓶中，加入3%的乙醇10.0mL，再加入0.7mL的5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，静置5min;加入0.7mL的10%AlCl3(w/w)溶液，摇匀，静置6min，加入5mL的10%氢氧化钠，30%的乙醇定容至刻度。放置10min后，以试剂空白作参比，于500nm波长处测定其吸光度。绘制浓度－吸光度曲线，对数据求算回归方程，得到芦丁标准工作曲线:y=7.447x+0.0433，R2=0.9999。黄酮提取率(%)=黄酮浓度/提取液浓度×100。

2 结果与分析

2.1 单因素分析

2.1.1 微波功率对玉米须总黄酮提取率以及酶抑制率的影响 从图2可知，当微波功率达到600W时，其总的提取效果最好。随着微波功率的继续增加，其总的提取效果不再发生显著变化。这可能是由于微波功率的继续增加，破坏了其有效成分，从而导致其总提取效果下降。综合考虑后，选取最适微波功率为600W。

图2 微波功率对玉米须黄酮提取率、酶抑制率的影响及提取总效果值Fig.2 Effect of microwave power on the yield of flavonoids，the enzyme inhibition ratio and the extraction total effect value

2.1.2 微波时间对玉米须总黄酮提取率以及酶抑制率的影响 从图3可知，当萃取时间在15min以下时，随着时间的延长，其总的提取效果没有多大变化。而当微波时间达到20min时，其总的提取效果达到最好。当时间再增长时，其总的提取效果反而减小。这一趋势与黄酮提取率、酶抑制率的单独效果趋势相同。这可能是由于在20min以下时，其提取效果不彻底;当提取时间大于20min时，其提取物又因为微波时间过长而被降解或破坏，导致其总的提取效果降低。综合考虑后选取最适微波时间为20min。

图3 微波时间对玉米须黄酮提取率、酶抑制率的影响及提取总效果值Fig.3 Effect of microwave time on the yield of flavonoids，the enzyme inhibition ratio and the extracting total effect value

2.1.3 乙醇浓度对玉米须总黄酮提取率以及酶抑制率的影响 从图4可知，提取物的总效果一开始随着乙醇浓度的增加而增大，当乙醇浓度为60%时，达到最大值。然后随着乙醇浓度的增加，其提取物的总效果降低。这一规律与黄酮提取率测定结果相符。当乙醇浓度为60%时，黄酮提取率最高;乙醇浓度增大或者减小，总黄酮的得率都减少。而酶抑制率最高时，乙醇浓度为50%。其主要原因是乙醇浓度不同，其提取剂的极性不同，所提取得到的黄酮类化合物种类不同，不同种类黄酮其酶抑制活性不同，从而造成50%乙醇浓度下的提取物的酶抑制率要高于60%条件下的酶抑制率。综合考虑后选取最适乙醇浓度为60%。

图4 乙醇浓度对玉米须黄酮提取率、酶抑制率的影响及提取总效果值Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids，the enzyme inhibition ratio and the extracting total effect value

2.1.4 液料比对玉米须总黄酮提取率以及酶抑制率的影响 从图5可知，当液料比小于20∶1(mL/g)时，其提取效果随着液料比的增加而逐渐增大;当液料比超过20∶1(mL/g)时，其提取效果反而下降。将黄酮提取率和酶抑制率分开来看，黄酮提取率随着液料比的增加变化不大;黄酮提取率随着液料比的增加变化显著:当液料比为20∶1(mL/g)时，酶抑制率效果最好。这是由于不同的黄酮化合物在溶剂中的溶解度不同，液料比为20∶1(mL/g)时所提取得到的黄酮化合物，其抗痛风效果最好。综合考虑后选取最适液料比为20∶1(mL/g)。

图5 液料比对玉米须黄酮得率、酶抑制率的影响及提取总效果值Fig.5 Effect of liquid－solid ratio on the yield of flavonoids，the enzyme inhibition ratio and the extracting total effect value

2.2 优化实验设计结果及分析

2.2.1 二次回归正交旋转组合设计 实验结果见表2。根据表2的结果，计算各项的回归系数，以此建立综合评分与微波功率、微波时间、乙醇浓度、液料比4个因子编码值的数学回归模型。

2.2.2 方差分析 方差分析结果见表3。

2.2.2.1 回归系数的显著性检验 将α值大于0.1的值剔除，得到优化后的回归方程为Y=19.53－0.67X3+0.80+0.92+1.01－1.26X1X2－1.19X3X4式(2)

2.2.2.2 回归方程的检验 F回=3.55669＞F0.1(15，21)=1.8271475，显著性良好，说明该回归模型的预测值与实际值拟合程度较好。

表2 二次回归正交旋转实验设计及实验结果Table 2 Design and results of quadric regression orthogonal rotary test

2.2.2.3 回归方程的失拟检验 Flf=5.06437＞F0.25(10，11)=3.902，说明求得的实验方程拟合不太好，即失拟平方和除含有实验误差、两两交互作用以及简单二次关系外，还有更高层次或者其它关系。

通过上述三项显著性分析可知，回归方程(1)的显著性水平为0.1，拟合效果一般。

2.2.3 单因素效应分析 采用降维分析法，将得到的回归方程中四个因素任意三个固定在零水平，依次得各单因素的数学模型。

从图6可以看出，四个因素中，除液料比随着因素水平的变化对总提取效果值没有太大的影响外，微波功率、微波时间以及乙醇浓度随着因素水平的提高均增大。其中，微波功率在－2～0水平对提取总效果没有太大影响。但在0～2水平，提取总效果随着微波功率的增加呈明显增加趋势;微波时间在－2～0水平逐渐增大时，提取总效果值缓慢增大;到微波时间为－0.5水平时，提取总效果值达到最大，而后逐渐降低;乙醇浓度在0水平对提取总效果影响最大。单因子变化趋势与实验所做的单因素变化趋势基本吻合，表明本实验应用二次正交旋转设计的可靠度比较高。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

表4 优化方案中各变量取值的频率分布Table 4 Frequency distributions of optimized parameter values

图6 单因素效应分析图Fig.6 Effect of single factors

2.2.4 微波萃取条件的优化 采用频率分析法寻优。利用DPS9.50进行优化，得率大于21.48%时，各变量取值的频率分布如表4。

从表4可知，在95%的置信区间内，微波功率的取值范围为 597.2～623.9W;微波时间 9.842～10.158min;乙醇浓度为68.975%～70.34%;液料比为18.36～18.988(mL/g)。综合考虑各种因素后，选取微波功率为600W，微波时间10min，乙醇浓度为70%，液料比为20∶1(mL/g)，在此条件下测得酶抑制率为39%，黄酮提取率为26%，则提取总效果值为35.1%。

3 结论

采用微波萃取方法对玉米须中抗痛风活性组分进行提取，通过单因素实验以及二次旋转正交组合优化实验方法对提取工艺进行优化，拟合了微波功率、乙醇浓度、液料比、微波时间四个因素对提取总效果的回归模型，将实验结果量化处理。此外，通过方差分析还可以得到各因素对总体效果的影响程度依次为乙醇浓度＞微波功率＞微波时间＞液料比，为玉米须抗痛风活性效果的进一步开发研究提供了有力依据。但通过分析也可以看出该实验结果的拟合效果一般，若想得到准确的数学模型还需进一步实验研究。

［1］孙爱宁，张日，吴德沛，等 .内科学［M］.北京:人民卫生出版社，2004.

［2］朱旭.玉米须抗痛风活性成分的筛选［D］.长春:长春中医药大学，2009.

［3］So Alexander.Developments in the scientific and clinical understanding of gout［J］.Arthritis research ＆ therapy，2008，10(5):221－226.

［4］Corradoa，D‘onofriof，Santoron，et al.Pathogenesis，clinical findings and management of acute and chronic gout［J］.Minerva，2006，97(6):495－509.

［5］Choi HK，Curhan G.Coffee，Tea，and caffeine consumption and serum uric acid level［J］.Arthritis ＆ Rheumatism，2007，57(5):816－821.

［6］夏道宗，张英，吕圭源.黄酮类化合物防治高尿酸血症和痛风的研究进展［J］.中国药学杂志，2009(10):721－723.

［7］Nguyen MT，Awale S，Tezuka Y，et al.Xanthine oxidase inhibitory activity of Vietnamese medicinal plants［J］.Biol Pharm Bull，2004(9):1414－1421.

［8］邱智东.玉米须提取物及其制备方法在制备治疗痛风药物中的作用［P］.中国:101444599A.2009－06－03.

［9］Xiao WH，Ham LJ，Shi B，et al.Microwave－assisted extraction of flavonoids from Radix Astragali［J］.Separation and Purification Technology，2008，62:614－618.

［10］Noro T，Oda Y，Miyase T，et al.Inhibition of xanthine oxidase from the flowers and buds of daphne genkwa［J］.Chem Pharm Bull，1983，31:3984－3987.

［11］Liu BG，Zhu YY.Extraction of flavonoids from flavonoid－rich parts in tartary buckwheat and identification of the main flavonoids［J］.Journal of Food Engineering，2007，78:584－587.

［12］Zhao WZ，Yu ZH，Liu JB，et al.Optimization of Microwave Extraction of Polysaccharides from Stigma Maydis by Central Composition Design［J］.African Journal of Food Science and Technology，2011，2(7):157－166.

［13］Zhao WZ，Yu ZH，Liu JB，et al.Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2011(12):2201－2209.

［14］Liu J，Wang CN，Wang ZZ，et al.The antioxidant and freeradical scavenging activities of extract and fractions from corn silk(Zea mays L.)and related flavone glycosides［J］.Food Chemistry，2011，126:261－269.

［15］王翠娜，刘静波，王二雷，等.玉米须食品化及分析研究进展［J］.食品科学，2010，31(15):304－307.

［16］刘军，刘静波，王作昭，等.玉米须黄酮类化合物构效及合成基因调控研究进展［J］.食品科学，2010，31(13):316－320.

［17］Umamaheswari M，Asokkumar k，Somasundaram A，et al.Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian medical plants［J］.Journal of Ethnopharmacology，2007，109:547－551.

［18］Chen HJ，Chung CP，Chiang W，et al.Anti－ inflammatory effects and chemical study of a flavonoid－enriched fraction from adlay bran［J］.Food Chemistry，2011，126:1741－1748.