高效液相色谱-质谱法测定棉籽仁中左旋和右旋棉酚含量

姚 军，何晓文，李新霞，*，张煌涛，鹿 毅

(1.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830054;2.新疆产品质量监督检验研究院，新疆乌鲁木齐830054)

棉酚(gossypol)，又称棉毒素或棉籽醇，是一种存在于锦葵科植物成熟种子中的黄色多羟基双萘醛化合物，可引起严重的低钾血症［1－2］和男性不可逆不育［3－4］，分子式为 C30H30O8。棉酚的分子结构中有一个手性轴，产生有左旋(－)－棉酚和右旋(+)－棉酚两种位阻光学异构体，天然棉酚一般以外消旋体(±)－棉酚的混合形式存在，见图1。近年来研究表明，(－)－棉酚表现出更强的毒副作用［5－6］，其中抗生精作用是(+)－棉酚的十倍，而(+)－棉酚几乎无活性。新疆是我国棉花的主产区，棉籽成为当地居民重要的油料资源，副产品棉粕因富含粗蛋白而作为优质的动物饲料，但棉酚的毒性限制了它的利用。目前，国家规定了食品和动物饲料中总游离棉酚限量≤0.02%，并制定了相关的检测方法［7－8］，国内外也有高效液相色谱法［9－10］、毛细管电泳法［11－12］、化学发光法［13］和红外法［14］等其他文献报道，主要集中在消旋体棉酚的定量研究，通常样品基质的干扰较大，前处理要求较高。本文在已有文献的基础上，建立一种高效液相－质谱法测定棉籽仁中(－)－棉酚和(+)－棉酚含量的检测方法，该方法专属性强，灵敏度高，样品处理简便易行，适于食品和饲料中(－)和(+)－棉酚的含量测定，为正确评估棉酚的毒性提供一定参考价值。

图1 (－)－和(+)－棉酚对映异构体Fig.1 The stereochemical structure of(－)－and(+)－gossypol

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

棉籽 乌鲁木齐北园春农产品批发市场;(±)－棉酚对照品 (CAS 号 303－45－7，纯度≥95%)、R－(－)－2－胺基－1－丙醇(CAS号 35320－23－1，纯度98%)美国Sigma公司;乙腈(色谱纯)美国Fisher公司;无水甲酸(色谱纯)天津光复精细化工研究所;石油醚(沸程30～60℃)、冰醋酸和N、N－二甲基甲酰胺 均为分析纯。

Agilent 1100高效液相色谱仪、Agilent 1946C质谱仪 美国Agilent公司;AB135－S型电子分析天平Mettler－Toledo公司;KQ－500DE型超声提取仪 昆山市超声仪器有限公司;DK－S22型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司;Milli－Q超纯水仪 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 (±)－棉酚衍生物储备液的制备 精密称取棉酚对照品 19.28mg，溶于含 2%R－(－)－2－胺基－1－丙醇和10%冰醋酸的N，N－二甲基甲酰胺溶液，置90℃下水浴30min，冷却后定容至100mL棕色容量瓶中，即得浓度为192.8μg/mL的(±)－棉酚衍生物储备液，于－20℃下避光保存，两个月内使用。临用时将储备液稀释至合适浓度。

1.2.1.2 供试品衍生溶液的制备 将棉籽脱壳取仁，捣碎并过60目筛，取约0.10g，置于具塞三角瓶中，加石油醚10mL，震荡混匀，室温下放置2h，过滤，取滤渣，加10%冰醋酸的N，N－二甲基甲酰胺15mL和2%(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇 0.2mL，超声处理30min;避光放置2h后，置90℃下水浴加热30min进行衍生化反应，冷却后定容至25mL棕色容量瓶中，作为供试品衍生溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。

1.2.2 分析条件

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent XDB－C18分析柱(250mm ×4.6mm，5μm);流动相:乙腈∶1.0% 甲酸 =85∶15;流速:1.0mL/min，柱后分流比 15%;柱温:25℃;进样量:20μL。

1.2.2.2 质谱条件 电喷雾电离源(ESI);离子极性:正离子模式(Positive);选择性离子监测(SIM):［M+H］+m/z 633.2;锥孔电压:90eV;传输区电压:200V;干燥气(N2)流速和温度:8L/min和350℃;雾化室压力:310kPa;毛细管电压:4000V。

2 结果与讨论

棉酚旋光异构体的物理化学性质极其相似，在常规C18色谱柱上的保留行为一致，手性分离的难度较大。本实验采用的柱前手性衍生化法，是一种间接分离对映体的方法，基本原理是将含醛基的(±)－棉酚与含伯氨的手性拆分试剂作用，转换成非对映异构体，然后利用它们在化学或物理化学性质上的差异使之分离。该反应是一种酸催化的亲核加成反应，溶液中微量的氢离子与羰基结合成金盐而增加羰基的亲电性能;但不能使用强酸，因为过量的氢离子和氨基结合形成铵离子衍生物，会丧失胺的亲核能力［15］，衍生化反应方程式，见图2。

图2 棉酚与(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇的衍生化反应Fig.2 The derivatization of gossypol with(R)－2－Amino－1－propanol

2.1 样品前处理条件的选择

2.1.1 提取工艺的优化 研究表明，游离棉酚易溶于油脂和中等极性的有机溶剂，不易溶于低沸点的石油醚、己烷和水。由于棉籽仁中含有大量的棉籽油，预先进行脱脂处理，可以提高棉酚的浸出速率;分别用丙酮、氯仿和N，N－二甲基甲酰胺溶液提取棉籽仁中的棉酚(n=3)，总游离棉酚的提取率相差不大;同时，本实验在提取液中加入10%冰醋酸，可有效地抑制棉酚的催化氧化反应，增强棉酚的稳定性。本实验最终采用含10%冰醋酸的N，N－二甲基甲酰胺溶液作为棉酚的提取溶剂，沸点较高，在后期水浴加热进行衍生化反应时，无需添加冷凝回流装置，操作简便，优于丙酮、氯仿等低沸点溶剂。

2.1.2 棉酚衍生化条件的选择

2.1.2.1 手性拆分试剂的选择 分别采用(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇［16］，(L)－(－)－2－氨基－3－苯基－1－丙醇［8］和(1R，2R)－2－氨基－1－(4－硝基苯基)－1，3－丙二醇［17－18］作为(± )－棉酚的手性拆分试剂。结果表明，(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇与棉酚的衍生化程度高，在色谱柱上分离效果较好。

2.1.2.2 衍生化条件的优化 以(R)－(－)－2－胺基－1－丙醇为手性拆分试剂，分别在 70、80、90℃下水浴加热进行衍生化反应，结果表明，棉酚在90℃水浴加热30min可基本完成衍生化反应。

2.2 质谱条件的优化

棉酚衍生物是一个Schiff碱类结构，经扫描离子(Scan)监测后，发现在正离子模式下，分子离子峰m/z=633.2具有较高的响应值;分别对各质谱参数进行优化，发现锥孔电压、干燥气流速对其影响较大，最佳条件分别为90eV和8L/min。

表1 基质效应考察结果(n=6)Table 1 Results of matrix effect(n=6)

表2 重复性实验结果(n=6)Table 2 Repeatabilities of(－)－and(+)－gossypol(n=6)

2.3 色谱条件的优化

分别使用甲醇和乙腈作为有机相洗脱剂，发现乙腈具有更高的响应值和更好的洗脱能力;分别考察0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%等不同比例的甲酸水溶液作为流动相调节剂，发现随着甲酸浓度的增大，质谱的响应值也随之增大，色谱峰也有较好的改善，但超过1.0%后变化不是很明显。综合考虑，以乙腈∶1.0%甲酸=85∶15作为流动相为宜。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 分别取(±)－棉酚对照品衍生溶液19.3μg/mL和供试品衍生溶液，按“1.2.2项”下进样分析，记录色谱图，结果表明，(－)－和(+)－棉酚的保留时间分别为8.1min和5.0min，对照品与供试品的保留行为一致，无杂质峰干扰。因此，该方法专属性良好，见图3、图4。

图3 (±)－棉酚对照品衍生溶液HPLC－MS色谱图Fig.3 HPLC－MS chromatogram of(±)－gossypol derivatives

图4 供试品溶液HPLC－MS色谱图Fig.4 HPLC－MS chromatogram of cottonseeds

2.4.2 线性与范围 分别精密吸取(±)－棉酚衍生物储备液适量，适当稀释，得系列浓度为1.93、4.82、9.64、19.3、28.9、38.6μg/mL 的(±)－棉酚对照品衍生溶液，按“1.2.2项”下进样分析。以(－)－和(+)－棉酚的总峰面积对溶液质量浓度进行线性回归，得(±)－棉酚回归方程 Y=117040X－130518，R2=0.9994(n=6)，在1.93～38.6μg/mL呈良好线性关系。

通过上述系列浓度(±)－棉酚对照品衍生溶液，以峰面积之比［19］得(－)－棉酚和(+)－棉酚的比例为48.8∶51.2。

2.4.3 检测限和定量限 取(±)－棉酚对照品衍生溶液，适当稀释，进样测定。当信噪比(S/N)为3时，测得(－)－和(+)－棉酚衍生物的检测限(LOD)分别为2.52ng/mL和3.41ng/mL;当信噪比(S/N)为10时，测得(－)－和(+)－棉酚衍生物的定量限(LOQ)分别为8.39ng/mL和11.4ng/mL。

2.4.4 基质效应考察 精密称取棉籽仁粉0.05g(7份)，一份留作空白本底，另外六份各加入(±)－棉酚对照品衍生溶液1.0mL作为质控样品，按“1.2.2项”下进样分析，分别记录相应峰面积。以加标样品色谱峰峰面积减去空白本底峰面积的差值，与对照品色谱峰峰面积的比值计算基质效应，均在85%～115%之间［20］，结果见表1。因此，认为该条件下的基质效应不明显，样品前处理过程除杂较干净。

2.4.5 重复性、精密度及稳定性实验 精密称取棉籽仁粉约0.10g(6份)，结果(－)－和(+)－棉酚含量的RSD分别为3.60%和2.87%(n=6)，表明该方法重复性良好，结果见表2;取同一供试品衍生溶液，连续进样6次，峰面积的RSD分别为1.57%和1.15%(n=6)，表明精密度良好;分别于室温下 0、2、4、6、8、12h进行测定，含量的RSD分别为2.33%和1.75%，表明供试品衍生溶液在12h内稳定。

2.4.6 回收率实验 精密称取棉籽仁粉0.05g(12份)，每组三份，其中一组样品留作空白本底，另外三组按低、中、高三个水平分别加入(±)－棉酚对照品衍生溶液0.2、1.0、3.0mL，分别计算(±)－棉酚中(－)和(+)－棉酚的回收率，结果见表3。

2.5 样品含量测定

采用本方法对乌鲁木齐市售的6批棉籽进行检测，结果(－)－棉酚含量为2.83～4.09mg/g，(+)－棉酚含量约为4.13～5.69mg/g，比例约为1∶1.45，结果见表4。

表3 (－)－和(+)－棉酚回收率实验结果(n=3)Table 3 Recoveries of(±)－gossypol at three spike levels(n=3)

表4 样品测定结果(n=3)Table 4 Contents of(－)－and(+)－gossypol in samples determined by the method(n=3)

3 结论

本实验采用高效液相－质谱法测定棉籽仁中左旋和右旋棉酚的含量，在样品前处理方法、质谱条件和色谱条件等方面进行优化，实验结果表明，新疆地区的棉籽仁中左旋棉酚的含量低于右旋棉酚，两者的比例约为1∶1.38～1.54。该方法专属性强，灵敏度高，样品处理简便易行，适于食品和饲料中(－)和(+)－棉酚的含量测定。

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