苦菜不同部位蛋白质和氨基酸含量分析

霍 莉，陈 萍，彭 松，胡晓洁，王 颉，*

(1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001;2.保定学院生化系，河北保定071000)

植物蛋白质由于不含胆固醇，容易消化，具有动物蛋白无法比拟的组成优势，而且氨基酸含量丰富，品质好，对提高人体免疫力、保肝具有良好的作用，倍受国内外研究者关注［1－4］。苦菜是一种药食同源的多年生菊科苦荬菜属草本植物，耐寒、耐热、耐旱、耐瘠薄性均较强，各地均可大面积种植，全草都含有人体需要的多种营养成分，有清热凉血、解毒、消肿排脓之功效［5－10］，但苦菜不同部位性能不同，韩阳阳等［11］研究了苦菜不同部位提取物的抗氧化活性，王天晓等［12］测定了苦菜的不同部位金属元素含量，而苦菜蛋白质有待开发，有望应用于医药、保健、化妆品等行业，不同部位蛋白质和氨基酸还未见考察。植物蛋白质和氨基酸测定方法有很多［13－16］，本文主要采用凯氏定氮法和高效液相色谱(HPLC)柱前衍生法对苦菜不同部位蛋白质和17种氨基酸含量进行测定，且采用了价廉的2，4－二硝基氯苯(CDNB)做衍生剂，重现性好，条件简便，毒性小［17］，丰富了植物氨基酸含量测定的方法。拟为苦菜的充分利用，进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦菜(山苦荬)河北保定田间，鲜苦菜→洗净→自然晾干→高速粉碎成粉末状;鲜苦菜含水量为84.24%(称重法);18种氨基酸标准对照品(见表2，还有色氨酸)北京拜尔迪生物技术公司和美国Sanland公司(纯度≥99%);2，4－二硝基氯苯 上海国药集团化学试剂有限公司进口部;乙腈为色谱纯;硫酸、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、无水硫酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、乙酸钠均为分析纯;盐酸为优级纯;混合指示剂:V(溶解于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液)∶V(溶于95%乙醇的0.l%甲基红溶液)=5∶1。

消解炉、凯氏定氮仪(KDY－9810)北京通润源机电有限公司;Agilent 1200高效液相色谱仪(四元梯度泵，DAD检测器)美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质的测定 按照国家标准GB 5009.5－2010食品中蛋白质的测定［18］:凯氏定氮法测定苦菜蛋白质含量。取0.5g样品粉末放入定氮瓶中，加入W(CuSO4)∶W(K2SO4)=1∶3 混合物 6g，再加入 10mL浓H2SO4，消煮至溶液呈透明的蓝绿色，冷却，加入10mL蒸馏水稀释。打开凯氏定氮仪，将消煮管固定于加碱处，加稍过量的400g/L的 NaOH溶液(约40mL)。将加有20mL 2%硼酸溶液和1～2滴混合指示剂的锥形瓶放在蒸馏托盘上，按蒸馏键进行蒸馏，当冷凝管口的冷凝液呈中性时(pH纸测定)即为蒸馏终点;取下锥形瓶，再滴加1滴混合指示剂，用已标定的HCl溶液进行滴定，溶液由浅绿色变为浅红色时即为滴定终点。根据公式计算蛋白含量:

表1 苦菜蛋白质含量Table 1 Content of Ixeris Chinensis(Thunb.)Nakai Protein on the different parts

式中:CHCl:HCl浓度(mol/L);V:样品耗HCl体积(mL);V0:空白耗HCl体积(mL);m:苦菜质量(g)

1.2.2 HPLC柱前衍生法分析氨基酸含量［17］

1.2.2.1 样品处理 精确称取的0.3g样品粉末于小瓶中，加入10.00mL 6mol/L盐酸，水解(110℃)14h，冷却到室温定容至10mL，取水解液1.00mL真空抽干，再加入2.00mL 0.1mol/L盐酸溶解，备用。

1.2.2.2 样品衍生 取100μL样品水解液于1.5mL离心管中，加入缓冲溶液(pH9.0)200μL、300mg/mL 2，4－二硝基氯苯100μL，混匀，于90℃恒温水浴锅中避光反应90min，反应结束后加入10%(v/v)乙酸50μL，调pH为中性，以水定容至1.00mL，混匀，取上清液过0.45μm有机膜后，待测。

1.2.2.3 标准样品处理 分别称取适量的18种氨基酸的标准品，用0.1mol/L HCl定容于10mL容量瓶中，得到浓度均为500mg/L的混合标准溶液。将氨基酸混合标准溶液分别稀释为 25、50、125、100、150、200、300、400、500mg/L 的溶液，各标液取 100μL 按照样品衍生方法衍生后进行测定，绘制标准工作曲线。

1.2.2.4 色谱条件 美国Kromat Universil C18柱(4.6mm×250mm，5μm);流动相A为乙腈;流动B为乙酸－乙酸钠缓冲液(0.03mol/L乙酸钠溶液，加入0.15%三乙胺，再用冰乙酸调pH至5.25±0.50);梯度洗脱:0～10min，B 的体积分数为82%;10～15min，B由82%～71%;15～25min，B 由 71%～66%;25～30min，B 由66%～45%;30～37min，B 由 45% ～40%;37～39min，B 由40%～82%;39～45min，B 为82%。进样量:10μL;柱温40℃;检测波长360nm。组分用定性保留时间，定量用外标法。

2 结果与分析

2.1 苦菜蛋白质含量

表1为凯氏定氮法测定春秋(5月和10月)两季苦菜以及苦菜不同部位(10月)蛋白质含量，可得到蛋白质含量大小:春季苦菜多于秋季苦菜;叶＞花＞茎＞根;且叶蛋白高于花、茎、根。

2.2 苦菜氨基酸含量测定

2.2.1 苦菜氨基酸组分及含量分析 2，4－二硝基氯苯(CDNB)衍化法测定苦菜氨基酸组分色谱图见图1，除色氨酸被水解破坏外，可以分离出17种氨基酸。春秋(5和10月)两季苦菜以及苦菜不同部位(10月)氨基酸组分及含量见表2:

图12 ，4－二硝基氯苯(CDNB)衍化法测定苦菜氨基酸组分色谱图Fig.1 Chromatogram of amino Acid Composition of Ixeris Chinensis(Thunb.)Nakai derivatized with CDNB

据表2可见，苦菜含有人体必需的(8种氨基酸)，半必需的丰富的氨基酸［19］，可以证明苦菜的药用价值。其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸含量较高，天冬氨酸、谷氨酸主要用于治疗肝病、神经衰弱、消化道疾病、脑病、心血管病、呼吸道等疾病［20］。亮氨酸用于平衡异亮氨酸，参与胸腺、脾脏及甲状腺、性腺的调节以及代谢;脯氨酸可协助胶原蛋白形成，刺激垂体分泌生长激素，可帮助牙釉质生长和提高机体免疫功能和降高血压作用［19，21］。且春季苦菜全草氨基酸总量略高于秋季，苦菜不同部位的氨基酸总量和各氨基酸含量(除酪氨酸(Tyr)外)大都为:叶＞花＞茎＞根，且叶中氨基酸显著高于花、茎、根;与上述蛋白质测定结果相同。其中还测定出苦菜叶和花中含有一定量的牛磺酸，且茎和和根中没有检测到。牛磺酸在植物中很少含有，海鲜和贝类中含量最为丰富［22］，牛磺酸具有抗氧化、抗衰老作用，可促进脂质代谢，提高免疫能力等功效。说明苦菜的营养和保健功能可进一步研究和开发。

2.2.2 方法的稳定性、精密度与回收实验 文献［17］考察方法的线性关系良好，此法用于苦菜氨基酸测定，将其衍生的对照品在室温放置0、1、2、3、4 d后进行测定，并以色谱峰峰面积为指标计算RSD，考察衍生物的稳定性，17种氨基酸标准溶液的稳定性实验RSD在1.80%～5.40%(n=5)，方法稳定性亦良好。

表2 苦菜氨基酸组分及含量Table 2 Contents of amino Acid Composition on Ixeris Chinensis(Thunb.)Nakai

取对照品溶液100μL连续进样5次以色谱峰峰面积为指标计算RSD，考察方法的精密度，17种氨基酸标准溶液的精密度实验RSD在1.0%～5.6%(n=5)。

以天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸为对象进行回收率测定。平行称5份适量苦菜叶样品，经水解后衍生后，将混合氨基酸标准(200 mg/L)添加到同一种样品中，进行回收率测定。三种氨基酸的相对标准偏差RSD和样品加标回收率见表3。结果表明，RSD在1.65%～1.89% 之间，样品加标回收率范围在103.2%～108.6%。说明该方法精密度和准确度较高。

表3 苦菜叶样品氨基酸回收率测定Table 3 Recovery of amino acid in leaf of Ixeris Chinensis(Thunb.)Nakai

3 结论

苦菜富有蛋白质和多种氨基酸。春季苦菜蛋白质和氨基酸含量多于秋季苦菜，苦菜不同部位的蛋白质和氨基酸总量以及各氨基酸含量明显不同，大都为叶＞花＞茎＞根，且苦菜叶和花中含有一定量的牛磺酸。为进一步研究、充分利用和开发苦菜不同部位功用提供理论依据。

采用改进的2，4－二硝基氯苯(CDNB)为衍生剂高效液相色谱柱前衍生法分析了苦菜氨基酸含量，氨基酸含量分析方法有很多:邻苯二醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(PITC)法、6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)法和9－芴甲基氯甲酸甲酯(FMOC)法、2，4－二硝基氟苯(DNFB)法，但都存在一定的缺点［14］。而试剂CDNB价廉易得、制备试样较简单、稳定、无干扰且分离效果好，适于含各种氨基酸试样的分析，丰富了植物氨基酸含量测定方法。

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