山仙颗粒含药血清对S－180肉瘤细胞bax、VEGF的影响＊

胥 冰 应小平 方 艳 吴肖晓 陕西中医学院（西安 712046）

我们通过长期临床观察表明，中药复方山仙颗粒（SXG）在抑制恶性肿瘤生长和转移方面均有较好疗效[1，2]。SXG以扶正固本、软坚散结、活血化瘀之大法[1]治疗恶性肿瘤，本研究旨在观察大鼠SXG含药血清对S-180肉瘤细胞bax、VEGF蛋白表达的影响，探讨其治疗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂 山仙颗粒（SXG）陕西中医学院附属医院制剂中心（生产日090328）一抗：Bax兔抗鼠多克隆抗体，二抗：生物素化羊抗兔IgG，VEGF鼠源单多隆抗体，荧光（FITC）标记羊抗兔IgG武汉博士德生物工程有限公司。DAB显色剂 北京博奥森生物技术有限公司 。

1.2 主要仪器 超净工作台 苏州净化，倒置显微镜 奥特BDS-200，二氧化碳培养箱 德国BindCD-150，倒置荧光数码显微镜 Nikon TS-100F（配 DS-5MC），研究级正置显微镜 Zeiss AxioImager A1（配Nikon DXM1200F），电子精密天平 塞多利斯，全自动高压灭菌器 日本三洋MLS-3780。

1.3 实验动物、瘤株 健康SD大鼠20只（雌、雄各半），6～8周龄，体质量（250±5）g，第四军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（军）2002-005；S-180肉瘤瘤株 第四军医大学。

2 实验方法

2.1 含药血清的制备及灭活 大鼠分笼饲养，适应性喂养1周随机分为4组（n＝5）：空白组；对照组；含药血清大剂量组；含药血清小剂量组。含药血清组，按中药人、鼠剂量换算标准换算后，以大鼠2.5g／（kg·次）（相当于临床等效剂量10倍），配制浓度为山仙颗粒（g）∶生理盐水（mL）为1∶2，配成0.5g／mL悬液，即5mg／（kg·次）灌胃给药，空白组，给予同剂量生理盐水[4]。于上、下午各灌胃1次，连续7d，末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12h）2h后，3%戊巴比妥钠0.15mL／100g腹腔注射麻醉，颈动脉采血，离心取上清液，经0.22μm滤器滤过除菌，同组混匀，经56℃，30min灭活后分装，－20℃保存备用。

2.2 细胞培养及扩增 将S-180肉瘤细胞接种于含10%胎牛血清、100u／青霉素、100U／链霉素的RPMI1640培养液中，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下扩增培养，取对数生长期细胞，制备成1×105／mL细胞悬液，接种于6孔板，每孔1800μl。分为4组，每组设3个复孔。于空白组：加入200μl小牛血清；含药血清大剂量组 ：加入200μl100%含药血清；含药血清小剂量组：加入100%含药血清20μl和小牛血清180μl，制成10%含药血清；对照组：加入200μl100%正常大鼠血清。

2.3 免疫细胞化学检测 S-180肉瘤细胞bax、VEGF的表达培养24、48、72h后，分别取出细胞离心洗涤，调整密度约为105个／mL制备细胞涂片，多聚甲醛固定。阻断内源性过氧化物酶，抗原热修复，按试剂盒说明操作S-P法免疫组化染色，光镜下观察，胞浆及核膜内出现黄色或棕黄色物质为Bax阳性细胞。胞质／胞核内出现黄褐色颗粒为VEGF阳性表达。随机选取5个视野（×200）分别计数Bax、VEGF阳性细胞数，计数100个细胞，计算阳性细胞表达率。

2.4 免疫荧光化学检测 S-180肉瘤细胞Bax、VEGF的表达分组培养24h，48h，72h后，同上法制备细胞涂片，固定阻断内源性过氧化物酶抗原热修复，5%BSA封闭液作用，按试剂盒说明操作，50%缓冲甘油封片避光，5min内快速在荧光显微镜下观察细胞。

3 结 果

3.1 免疫细胞化学检测S-180肉瘤细胞bax、VEGF的表达 bax定位于细胞浆及核膜，阳性表达呈黄褐色颗粒；VEGF定位于胞质／胞核，光镜下观察，由图1、2及表1、2可知，含药血清大、小剂量组在24h、48h、72h内S-180肉瘤细胞中bax、VEGF表达均有显著性差异（P＜0.05），bax随作用时间延长而增高；相反VEGF随作用时间延长而降低。大、小剂量组与对照组比较及大、小剂量组间比较均有极显著性差异（P＜0.01）。

图1 免疫细胞化学法检测S-180肉瘤细胞bax的表达（×200）

图2 免疫细胞化学法检测S-180肉瘤细胞VEGF的表达（×200）

图3 免疫荧光化学法检测S-180肉瘤细胞bax的表达（×200）

图4 免疫荧光化学法检测S-180肉瘤细胞VEGF的表达（×200）

表1 各组不同时间段对S-180细胞bax表达的影响（）

表1 各组不同时间段对S-180细胞bax表达的影响（）

注：各组与相同时段对照组比较，△P＜0.05；相同组在不同时段比较，▲P＞0.05，◇P＜0.05

组 别 n 24h 48h 72h空白组 538.17±5.36▲ 35.68±4.52▲ 30.83±3.69▲含药血清大剂量 556.15±2.08△◇52.06±3.12△◇54.21±1.98△◇含药血清小剂量 547.36±3.32△◇44.52±5.43△◇41.87±2.96△◇对照组 536.52±4.21▲ 34.06±6.39▲ 31.25±7.29▲

表2 各组不同时间段对S-180细胞VEGF表达的影响（）

表2 各组不同时间段对S-180细胞VEGF表达的影响（）

注：各组与相同时段对照组比较，△P＜0.05；相同组在不同时段比较，▲P＞0.05，◇P＜0.05

组 别 n 24h 48h 72h空白组 566.25±4.38▲ 65.16±3.82▲ 63.34±6.85▲含药血清大剂量 548.09±3.15△◇42.29±4.17△◇39.72±5.32△◇含药血清小剂量 553.33±2.83△◇48.47±3.25△◇41.87±4.18△◇对照组 567.29±4.61▲ 63.54±3.05▲ 60.07±5.13▲

3.2 免疫荧光化学法检测S-180肉瘤细胞bax、VEGF表达 bax表达于胞浆和核膜上，VEGF定位于胞质／胞核，荧光显微镜下观察，由图3、4知，呈明显黄绿色鲜艳荧光，含药血清大、小剂量组在 24h，48h，72h 时，S-180肉瘤细胞中 bax、VEGF表达，随血清作用时间延长，bax荧光亮度增强，VEGF荧光亮度减弱；含药血清大、小剂量组中bax荧光亮度明显增强，VEGF荧光亮度明显减弱，与对照组比较，有显著性差异，大、小剂量组比较，肉瘤细胞中的bax、VEGF的表达有差异。

4 讨 论 山仙颗粒（SXG）为中药复方制剂，在抑制恶性肿瘤生长和转移方面均有较好疗效[3，4]。SXG以西洋参滋阴补气，清热生津；莪术能行气破血，消积止痛；生山楂等助莪术行气，消食化积，活血化瘀；龟板抑阴潜阳；仙鹤草补虚扶正，诸药合用共奏扶正固本，软坚散结，理气化滞之功。显示出较好的临床效果，本实验采用免疫组化法及免疫荧光化学法检测S-180肉瘤细胞中bax、VEGF表达。bax为凋亡促进基因，bcl-2是凋亡抑制基因，其基因蛋白产物能抑制细胞凋亡，延长细胞生存周期；Bax基因的蛋白产物可与bcl-2形成异二聚体，使bcl-2的抗凋亡能力丧失而促进细胞凋亡。与正常组织相比，在肿瘤组织Bax往往低表达。本实验发现S-180肉瘤细胞中Bax在不同剂量SXG含药血清中表达升高，表明山仙颗粒含药血清能上调bax蛋白表达。与应小平等报道山仙颗粒对小鼠S180肉瘤组织中Bax基因表达的影响结果相同[5]。

肿瘤生长依赖新生血管的形成已经是肿瘤生物学上研究比较透彻的一个方面。肿瘤生长依赖血液供应，需要生成新生血管，而血管内皮生长因子（VEGF）在新生血管生长过程中能强烈促使血管内皮有丝分裂并最终形成新生血管，为肿瘤的生长提供丰富的营养充足的血供。是刺激肿瘤血管生成最强的细胞因子[6]。VEGF过表达，通过促进肿瘤血管的生成而促进细胞的生长。不同剂量SXG含药血清有效地抑制VEGF的表达，与崔刘福等报道结果一致[7]。

综上所述，SXG含药血清具有诱导肿瘤细胞凋亡，对大鼠S180肉瘤具有抑制作用。机制可能与其能明显增强S-180肉瘤细胞中Bax基因的表达，降低VEGF的表达诱导肉瘤细胞的凋亡而实现的。但SXG成分复杂，是否通过其他途径达到抗肿瘤效果。确切的抗癌作用机制尚不完全明确，有待于进一步研究。

[1]王希胜，陈光伟，李红廷，等.山仙颗粒治疗恶性肿瘤56例[J].陕西中医，2002，23（9）：778.

[2]李光耀，辛春雷，张彬海，等.海生素对K562细胞生长及凋亡基因表达的影响[J].解剖学报，2008，39（5）：713.

[3]金泉克，肖海娟，孙 珏，等，中药复方肠胃清含药血清对胃癌SGC7901细胞凋亡的影响[J].中国中医药信息杂志，2012，19（5）：34-35.

[4]曹治云，杜 建.扶正抑瘤方对ICR小鼠H22皮下移植瘤组织中凋亡相关因子表达的影响[J].福建中医药大学学报 ，2012 ，22 （2）：27.

[5]应小平 ，史迎丽 ，郭兰生，等.山仙颗粒对小鼠S180肉瘤组织中Bax基因表达的影响[J].现代肿瘤医学，2007，15（9）：1240.

[6]段泽星，谢立群.VEGF在肿瘤生长和血管生成中的作用[J].世界华人消化杂志，2010，18（27）：2894-2896.

[7]崔刘福，姚树坤，宋海澄，等.肝癥口服液含药血清抑制肝癌细胞SMMC-7721血管内皮生长因子表达[J].中国中医基础医学杂志，2004，10（5）：52.