CD151基因转移对大鼠缺血后肢Rac1和Cdc42信号通路的影响

刘伟峰 于晓晖 刘正湘 左后娟 (淄博市中心医院心内科，山东 淄博 55036)

四跨膜超家族蛋白(TM4SF)是细胞膜上蛋白质分子进化过程中序列高度保守的一类蛋白族群，亦是整合素的关联蛋白〔1〕，其中CD151是TM4SF最重要的成员之一。我们过去的研究均证实CD151能促进血管新生〔2～4〕，但目前其作用的分子机制仍不清楚，Rac1和Cdc42信号分子与血管新生过程关系密切，在本研究中，我们通过重组腺相关病毒载体(rAAV)将CD151基因转染至大鼠后肢肌肉组织中，然后建立后肢缺血模型，通过观察CD151基因表达情况以及对Rac1和Cdc42信号通路的影响来进一步揭示CD151促血管新生的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 pZeoSV-CD151由美国Tennessee大学惠赠。p-AAV-GFP由美国北卡罗莱那州立大学基因治疗中心馈赠。大肠杆菌E.coliDH5α菌株(Invitrogen公司)。质粒p-AAV-CD151由本课题组前期构建。羊抗人CD151抗体(Santa Cruz公司)、PVDF膜(Life Science公司)。化学发光试剂ECL(Pirce公司)。β-actin抗体(Santa Cruz公司)，Rac1、Cdc42和 phospho-Rac1/cdc42(Cell Signaling Technology公司)。按照三质粒共转染方法在人胚肾上皮细胞系(293细胞)包装和复制生成rAAV-CD151和rAAV-GFP病毒，并用实时PCR法测定病毒滴度。

1.2 大鼠后肢局部转染重组腺相关病毒 成年Wistar雄性大鼠，体质量200～250 g，随机分为假手术组、缺血对照(生理盐水)组、GFP组和CD151组，分别经肌肉多点注射生理盐水，rAAV-GFP和rAAV-CD151(1.5×l011pfu/只)，假手术组和缺血对照组仅注射相同体积的生理盐水。注射位点分别为:股内收肌(3点)、股四头肌(3点)、半膜肌(2点)，腓肠肌(2点)，每个注射位点100 μl。基因转染1 w后制备大鼠后肢缺血模型。

1.3 大鼠后肢缺血模型的建立 2%戊巴比妥钠(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。行大鼠左后肢纵行切口从腹股沟韧带向下延伸至膝关节。在股动脉起始部和远端隐动脉与腿弯动脉分叉之间游离股动脉，结扎所有游离段股动脉分支，切除股动脉，建立大鼠后肢缺血模型，假手术组施行相同的手术步骤，但不切除股动脉。

1.4 Western印迹检测局部肌肉组织CD151、Rac1和Cdc42的表达 术后5 w检测四组样品的CD151蛋白表达情况，以βactin为内参照。分别提取四组大鼠缺血后肢肌肉组织蛋白。取含等量蛋白质的裂解液加等体积2×加样缓冲液(不含2-巯基乙醇)行SDS-PAGE电泳，电泳结束后25 V、4℃条件下过夜将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，37℃ 1%脱脂奶粉封闭2.5 h后分别与相应抗体4℃孵育过夜，1∶5 000辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h。最后经ECL显色检测结果。

2 结果

2.1 CD151蛋白质表达的检测 各组动物肌肉组织均出现特异性条带，假手术组、缺血对照组、GFP组条带较窄且颜色较浅，CD151组呈现宽且颜色深的条带(图1)，结果显示CD151蛋白质表达明显增加〔(410.7±18.6)%〕，与缺血对照组、GFP组比较差异有统计学意义〔(201.3±16.7)%vs(209.6±19.4)%，P＜0.05〕，缺血对照组、GFP组比较表达差异无统计学意义(P＞0.05)，假手术组CD151蛋白质表达最少(100%)。说明CD151基因的导入明显增加CD151蛋白质的表达。

2.2 CD151基因转染对Rac1和Cdc42信号通路的影响Western印迹免疫印迹检测p-Rac1/Cdc42、Rac1/2/3和Cdc42，p-Rac1/Cdc42分别用Rac1/2/3和Cdc42进行标准化处理，p-Ccdc42表达量 CD151组(503.6±20.1)%、缺血对照组(137.3±13.4)%、GFP组(144.6±12.7)%、假手术组为100%;p-Rac1表达量为CD151组(547.6±23.4)%、缺血对照组(140.6±12.4%)、GFP组为(147.2±13.2)%、假手术组为100%;结果显示CD151组p-Rac1/Cdc42蛋白表达明显高于其余三组(P＜0.01)，表明CD151蛋白表达的增加激活Rac1和Cdc42信号通路(图2)。

图1 Western印迹检测大鼠缺血后肢CD151蛋白表达

图2 Western印迹检测大鼠缺血后肢p-Rac1/Cdc42、总Rac和总Cdc42的蛋白表达

3 讨论

血管新生是体内重要的病理生理过程，在肿瘤的转移浸润以及缺血性疾病的血运重建等病理生理过程中发挥着十分重要的作用，它是指内皮细胞通过增殖和分化在原有血管基础上以芽生或非芽生的形式生成血管〔5〕。

CD151能够促进脐静脉内皮细胞增殖、迁移及网管状结构的形成〔2〕，且能够促进缺血组织的血管形成并在一定程度上改善这些缺血组织器官的功能〔3，4〕。但CD151促血管新生的分子机制仍不明确，在进一步的研究中我们发现CD151蛋白表达可以激活缺血组织的MAPKs和PI3K/Akt信号通路，上述信号分子被认为参与了血管新生过程〔3，4〕，但是除此之外CD151是否还激活了其他的与血管新生有关的信号通路，Rac1和Cdc42信号分子与血管新生过程关系密切，内皮细胞在Matrigel模型中形成毛细血管管腔结构的过程中Rac1和Cdc42发挥了重要作用〔6〕，研究发现CD151基因缺失小鼠肺内皮细胞的趋化迁移，伸展和侵袭能力减弱，同时该细胞的Rac1和Cdc42活性明显减弱〔7〕，表明Rac1和Cdc42参与了小鼠肺内皮细胞的趋化迁移和伸展等过程。

本研究显示将CD151基因转染至大鼠后肢肌肉组织内，6 w后CD151蛋白质表达明显增加，表明外源性CD151基因能够在大鼠缺血肌肉组织中有效表达，同时表明CD151可以激活Rac1和Cdc42信号通路，进而促进缺血下肢的血管新生，改善缺血肢体的功能。本实验进一步丰富了CD151促血管新生的分子机制。

1 Hemler M.Tetraspanin functions and associated microdomains〔J〕.NatRev Mol Cell Biol，2005;6(10):801-11.

2 Zheng Z，Liu Z.CD151 gene delivery increases eNOS activity and induces ECV304 migration，proliferation and tube formation〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2007;28(1):66-72.

3 Zuo H，Liu Z，Liu X，et al.CD151 gene delivery after myocardial infarction promotes functional neovascularization and activates FAK signaling〔J〕.Mol Med，2009;15(9-10):307-15.

4 Zheng Z＇Liu Z.CD151 gene delivery activates PI3K/Akt pathway and promotes neovascularization after myocardial infarction in rats〔J〕.Mol Med，2006;12(9-10):214-20.

5 Dvorak H.Angiogenesis:update 2005〔J〕.J Thromb Haemost，2005;3(8):1835-42.

6 Bayless K，Davis G.The Cdc42 and Rac1 GTPases are required for capillary lumen formation in three-dimensional extracellular matrices〔J〕.J Cell Sci，2002;115(6):1123-36.

7 Takeda Y，Kazarov A，Butterfield C，et al.Deletion of tetraspanin Cd151 results in decreased pathologic angiogenesis in vivo and in vitro〔J〕.Blood，2007;109(4):1524-32.