低剂量雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠nephrin表达的影响

邹 琦 郑祥雄 (福建医科大学协和临床医学院肾内科，福建 福州 350001)

糖尿病肾病是糖尿病的主要微血管并发症之一，是以早期发生蛋白尿，随后逐渐出现肾小球滤过率下降，并伴有肾小球硬化为特征。肾小球滤过屏障功能障碍可导致蛋白尿的发生。然而目前对于糖尿病肾病蛋白尿的发病机制尚未完全阐明。越来越多的证据表明足细胞对于肾小球滤过屏障选择渗透性的改变起到重要的作用，随着对足细胞研究的深入，也逐渐认识到足细胞在糖尿病肾病发病中的重要作用。本研究通过建立糖尿病肾病模型，观察低剂量雷帕霉素对大鼠肾脏病理改变，以及足细胞特异的蛋白分子nephrin表达的影响，探讨低剂量雷帕霉素能否通过维持足细胞结构完整而发挥对早期糖尿病肾病的肾脏保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择清洁级健康雄性SD大鼠(由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供)，体重200～250 g，生长良好，大鼠放置在通风良好，18～22℃恒温环境中分笼饲养(每笼3只)，提供12 h交替照明，给予标准饲料及饮用水。将大鼠分为正常对照组(C组，n=7)，糖尿病组(D组，n=7)，雷帕霉素治疗组(R组，n=8)。

1.2 主要试剂 兔抗大鼠 nephrin(SANTA CRUZ，美国)，通用型二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，TRIZON(Invitrogen，美国)，cDNA第一链合成试剂盒kit1(Fermentas，立陶宛)。

1.3 动物模型建立 大鼠禁食12 h后，予1%链脲佐菌素(STZ)溶液按75 mg/kg一次性腹腔内注射。STZ注射72 h后，尾静脉取血测血糖，以血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。造模后第7、14、28天再次测血糖，仍符合上述标准者为稳定成模的大鼠，进入后续实验，不符合者退出实验。

1.4 实验方法 第5周起R组大鼠按1 mg/kg体重给予0.3%雷帕霉素溶液每日灌胃给药，C组和D组以相同体积0.5%羧甲基纤维素溶液灌胃，共干预8 w。所有大鼠在实验期间均喂食标准饲料，自由饮水，不使用胰岛素。各组大鼠喂养至12 w，处死前1 d将大鼠放入代谢笼中，禁食不禁水，以免食物残渣污染尿液。收集大鼠24 h尿液。心脏穿刺抽血3 ml离心后取血清用于生化指标检测;处死后取部分肾皮质在冰面上切修成1 mm的薄片置于3%戊二醛中，4℃固定，用于透射电镜检查;部分肾组织置于4%多聚甲醛固定24 h，用于免疫组化检查;其余肾组织置于干燥EP管中，置入液氮中保存，用于RT-PCR检测。

1.4.1 观察指标 采用BCA法检测24 h尿蛋白，采用全自动生化分析仪检测血糖、血肌酐、尿肌酐，并通过公式计算内生肌酐清除率(Ccr)。Ccr(ml/min)=尿肌酐(mmol/L)×尿量(ml)/血肌酐(mmol/L)×1 440，体重校正的 Ccr〔ml·min－1·100 kg－1〕=Ccr/BW(g)×100，通过透射电镜检查足细胞超微结构。

1.4.2 免疫组化检测 石蜡包埋切片常规脱蜡至水，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶15 min，PBS冲洗3次，加血清封闭非特异抗体，予一抗(兔抗大鼠 nephrin 1∶100)4℃过夜孵育，滴加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体，37℃孵育30 min;DAB显色，苏木素复染。PBS代替一抗作阴性对照。显微镜观察并摄片。nephrin蛋白表达采用半定量分析，在高倍镜下(400×)每张切片按顺时针方向沿肾皮质随机选取10个肾小球，分别摄片。应用图像软件分析系统(Image-Pro-Plus6.0)分别计算每个肾小球上nephrin表达的整合光密度(IOD)及相应的肾小球面积，两者比值即为每个肾小球nephrin表达的肾小球阳性指数，取10个肾小球该比值的均数，即为每张切片nephrin阳性表达的肾小球指数。肾小球阳性指数=肾小球内各指标阳性表达整合光密度/相应肾小球面积。

1.4.3 RT-PCR检测 取液氮中冻存的肾皮质约100 mg，在陶瓷研钵中研磨成粉末，用Trizol试剂标准程序提取肾皮质总RNA。紫外分光光度计测定260 nm和280 nm波长的A值，计算RNA浓度。取2 μg RNA按cDNA第一链合成试剂盒说明配制反应体系，进行逆转录合成cDNA。取1 μl模板cDNA，用nephrin、β-actin引物进行PCR扩增。引物由上海生工合成。1)nephrin:上游引物:5`-CGTCAGCATCAGCAGCAACC-3`，下游引物:5`-AGCCACATCTTCCAGCCTCTC-3`，扩增产物 72 bp;2)β-actin:上游引物:5'TGTTGTCCCTGTATGCCTCTG 3'，下游引物:5'ACCGCTCATTGCCGATAGTG 3'，扩增产物348 bp。反应条件:94℃预变性 3 min，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃终末延伸5 min，共35个循环。取PCR产物，在2%琼脂糖凝胶中电泳，利用凝胶成像系统进行阳性条带吸光度积分扫描并记录。用β-actin作为内参照校正，用目的基因的吸光度与β-actin的吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。计量资料用±s表示，方差齐者组间比较用LSD检验，方差不齐者用Games-Howell检验。

2 结果

2.1 观察指标 12 w末，D组大鼠血糖、体重校正的Ccr、24 h尿蛋白与C组比较明显增多(P＜0.01)，R组大鼠体重校正的Ccr、24 h尿蛋白与D组比较明显减少(P＜0.01)。见表1。

表1 12 w末各组大鼠血糖、体重校正的Ccr、24 h尿蛋白比较(±s)

表1 12 w末各组大鼠血糖、体重校正的Ccr、24 h尿蛋白比较(±s)

与C组比较:1)P＜0.01，与D组比较:2)P＜0.01

组别 n 血糖(mmol/L)体重校正的Ccr(ml·min －1·100 kg-1)24 h尿蛋白(mg/24 h)7 6.41±1.06 0.49±0.05 6.79±0.50 D组 7 30.63±0.981) 0.87±0.111) 98.81±3.601)R组 8 29.54±1.101) 0.68±0.142) 51.58±2.111)2)C组

2.2 肾组织超微结构检查 透射电镜下观察，C组足细胞结构完整，足突形态细长、规则，排列整齐，基底膜无明显增厚;D组见基底膜节段性增厚，足突排列不齐，可见足突增宽、融合，部分可见足突消失。R组上述改变较DN组减轻。见图1。

图1 电镜下足细胞超微结构图

2.3 肾组织免疫组化半定量分析 12 w末，D组大鼠nephrin蛋白表达较C组明显减少(0.018 3±0.001 2 vs 0.081 1±0.004 1，P＜0.01)。R组大鼠nephrin蛋白表达与D组相比明显增多(0.026 3±0.001 5，P ＜0.01)。见图2。

图2 12 w末各组大鼠肾小球nephrin的表达

2.4 RT-PCR检测 12 w末，D组大鼠nephrin mRNA表达水平较C组明显减少(0.342 2±0.025 2 vs 0.636 7±0.017 4，P＜0.01)。R组大鼠 nephrin mRNA表达水平较D组增多(0.432 3±0.019 7，P＜0.01)。见图3。

图3 各组大鼠肾小球nephrin mRNA的表达

3 讨论

蛋白尿是糖尿病肾病的重要临床表现。长期蛋白尿是慢性肾脏疾病肾功能损伤进展的独立危险因素。减少尿蛋白排泄可延缓肾病的进展〔1，2〕。肾小球滤过屏障是由肾小球内皮细胞、肾小球基底膜、足细胞构成的。足细胞即肾小球脏层上皮细胞，是一类具有独特结构及功能的细胞。足细胞的足突通过-α3β1整合素和肌营养不良蛋白聚糖黏附于肾小球基底膜(GBM)上〔3〕。相邻足细胞的足突之间相互交错形成直径为30～40 nm的裂孔，孔上覆盖一层厚4～6 nm的裂孔隔膜(SD)，水和小分子物质可以自由通过裂孔隔膜，但大分子的血浆蛋白不能通过。因此，足细胞与足突之间的裂孔隔膜成为阻止蛋白通过的最终屏障。当足细胞受损时，足突的正常结构发生改变，滤过膜完整性受到破坏，导致蛋白尿发生。

nephrin，CD2AP，podocin等多种蛋白质分子组成SD复合物，其中一些蛋白质分子在维持SD复合物结构和功能完整性方面发挥重要的作用。NPHS1的蛋白产物nephrin，仅在肾脏足细胞中表达〔4〕，nephrin与podocin相互作用，通过CD2相关蛋白(CD2AP)结合在细胞骨架上。Putaala等〔5〕研究发现，NPHS1失活的大鼠出现蛋白尿及部分足突消失;同样，Orikasa等〔6，7〕研究也发现对大鼠注射抗nephrin抗体也可导致蛋白尿的发生。通过对微小病变肾病及嘌啉霉素肾病模型的研究发现nephrin mRNA低表达与蛋白尿发生呈负相关〔8，9〕nephrin与蛋白尿的产生密切相关，可推测nephrin对于维持肾小球滤过屏障的功能起重要作用。有研究证实糖尿病肾病中由于高血糖、糖化血红蛋白及血管紧张素Ⅱ增多使nephrin表达下调〔10〕。本实验结果显示糖尿病肾病组大鼠24 h尿蛋白排泄较对照组明显增多，电镜观察提示糖尿病组大鼠出现足突增宽、融合，部分可见足突消失，免疫组化及RT-PCR半定量分析提示nephrin蛋白及mRNA表达均较对照组明显减少。因此，由于糖尿病肾病时循环中的血糖、AGE、ANGⅡ、ROS、TGF-β等因素的增加均可诱发nephrin的表达下调，引起裂孔隔膜分子结构改变，导致足突形态变化，出现足突增宽、融合，使血浆蛋白通过的最终屏障被破坏，血浆蛋白漏出，产生蛋白尿，从而促进糖尿病肾病进展。

雷帕霉素临床上作为免疫抑制药用于肾移植患者抗排斥反应。近年的研究发现，雷帕霉素对某些慢性肾脏疾病可能具有治疗的潜力。Torras等〔11〕通过建立两种不同发病机制的肾病模型，发现雷帕霉素对于两种肾病模型在肾脏损伤、蛋白尿排泄及足细胞损伤的影响具有两种相反的作用，其可减轻慢性肾脏疾病的蛋白尿，并使nephrin的表达增加。本实验可推测低剂量雷帕霉素可通过缓解高血糖等因素造成的足细胞损伤，维持裂孔隔膜结构完整而发挥肾脏保护作用。

蛋白尿的出现可加重糖尿病肾病的肾脏损害。近年来，越来越多证据表明足细胞对于糖尿病肾病早期肾脏结构和功能改变起重要作用。其中足突间的SD的完整性是使肾小球滤过屏障具有高度渗透选择性的重要因素之一，SD损伤直接导致蛋白尿的发生。近年研究表明低剂量雷帕霉素可减轻蛋白尿的发生，对于慢性肾损伤，低剂量雷帕霉素可通过增加nephrin及podocin的表达，维持肾小球滤过屏障及足细胞结构完整性，使蛋白尿排出减少，从而延缓糖尿病肾病的进展。

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