绒毛细胞培养染色体分析及50例核型报道

王玉萍，浦 春，武其文

(皖南医学院附属弋矶山医院检验科，安徽 芜湖 241001)

染色体病是由于先天性的染色体数目及结构异常引起的疾病，新生活婴染色体异常发生率约为0.73%，有效预防方法是行产前诊断进行出生前干预。介入性产前诊断的方法主要有绒毛、羊水、脐血染色体检查[1]。绒毛染色体检查适用于孕8～11周左右，能早期发现染色体异常，主要运用于及早进行诊断的应急病例和已停止发育的胎儿染色体分析。我们就绒毛染色体的培养、制作方法进行了探索，取得了满意的结果。

一、材料和方法

1.病例来源 所有50例病例均来自于皖南医学院附属弋矶山医院妇产科门诊自然流产孕妇，在行清宫术时留取标本，其中第1次自然流产者31例，第2次自然流产者19例，年龄21～32岁之间，B超确认孕周为8～11周之间。

2.试剂 细胞培养液，GIBCO生产的AmnioMAXTM-Ⅱ;胰蛋白酶购自湖南湘雅生物技术有限公司;胶原酶Ⅱ购自BOMEI公司;秋水仙素购自广州达晖公司;Giemsa染液购自湖南湘雅生物技术有限公司。

3.仪器 CO2培养箱由Thermo公司生产;超净工作台由苏州安泰空气技术有限公司生产;KX-21倒置显微镜、BX-51正置显微镜均为OLYMPUS公司生产。

4.方法 (1)标本留取:在孕8～11周流产孕妇负压吸宫时，无菌操作吸取绒毛组织放入无菌培养皿，加入无菌生理盐水约5 mL，清洗数遍即可。挑取绒毛约10 g放入另一培养皿，加入0.25%胰酶3 mL，再加入1%胶原酶Ⅱ6 mL，轻轻混匀，剪碎绒毛组织，放入37℃培养40 min;(2)标本培养:将上述悬液离心，弃去上清液，剩余约0.5 mL，加入细胞培养液5 mL，混匀，将混悬液吸入培养瓶中，置37℃ CO2培养箱培养;(3)细胞观察:当培养至4～7 d，将培养瓶取出，置倒置显微镜下观察细胞生长情况，若细胞生长良好，细胞克隆较多，即可进行换液;(4)收获:当有较多圆形发亮的细胞出现时，即可收获。加入秋水仙素1 h，将液体析出，加入预温至37℃枸盐酸钠与胰酶9∶1配成的液体1 mL，反应3 min，再将之前的液体倒回，用细胞刮刀刮下瓶壁上的细胞，倒入刻度离心管离心，弃去上清液，低渗20 min，再经预固定、固定后滴片，75℃烘烤3 h，染色分析。

二、结 果

采用上述方法培养绒毛50例，检出异常核型17例，异常核型检出率34%，均为染色体数目异常。其中性染色体异常3例，常染色体异常14例，常染色体异常中多倍体2例，21-三体2例，非整倍体三体及单体10例。异常核型检出情况见表1。

表1 50例绒毛异常核型检出情况

三、讨论

作为产前诊断的一部分，绒毛细胞培养染色体分析因牵涉到的环节多，胎儿流产后没有再次复查的可能，使得其成为一项综合性非常强的实验技术。绒毛染色体技术包括直接制备和培养制备2种方法，直接制备由Simoni等[2]首次提出，但染色体分裂相对较少，易受母体污染，成功率较低;培养法获得的染色体质量好，核型多，母体污染少，嵌合体少，成功率较高。其中最主要是掌握好胰酶消化绒毛的时间、细胞培养和收获时间。以下几点值得注意。

首先胰酶消化的时间要掌握好，时间过短细胞少，核型少不够分析，时间过长细胞受到破坏，也会导致核型减少。本室消化40 min，效果满意。

细胞长到4 d后，每天要进行观察，如果细胞克隆多，可换液;如果细胞克隆少，可吹吸细胞克隆，使细胞脱落下来，再移入另一培养瓶内，继续生长2～3 d，细胞克隆明显增多。

收获时时间要掌握好，当大多数克隆细胞密度较高、细胞形态好、折光度较好、其中有较多圆形发亮的细胞出现时，即可收获，此时细胞已进入分裂中期，分裂相多。

绒毛细胞是胚胎外胚层细胞，具有与胚胎组织相同的遗传性状，利用绒毛染色体检查技术可以了解胚胎细胞的遗传学特点，为探讨流产的原因提供依据。据报道，在早期胎儿自然流产病例中，染色体异常占50%以上[3]，本研究中50例核型中，发现异常核型17例，异常核型检出率34%，均为染色体数目异常。其中性染色体异常3例，常染色体异常14例，常染色体异常中多倍体2例，21-三体2例，非整倍体三体及单体10例。染色体数目异常是导致胚胎早期流产的主要原因，因为染色体数目异常的胚胎，遗传缺陷大，导致遗传物质不平衡，致死性高[4]。本研究中异常核型检出率低于报道，可能与标本例数较少有关，但也充分说明了染色体异常是导致孕早期自然流产的主要因素，因此临床遇有孕早期出血孕妇，不宜盲目保胎。本研究未发现结构异常，有待于在今后的工作中继续积累病例数进行统计。

绒毛染色体培养成功与否与检测方法、标本采集、稽留时间均有关[5]，本室50例标本全部培养成功，这与严格掌握无菌操作、胚胎停止发育时间至吸宫时间短，流产绒毛标本新鲜有关。

综上所述，严格控制操作条件，用上述方法培养绒毛细胞成功率高，获得的分裂相多，该法可用于孕早期流产胎儿原因分析。

[1]王 昕，王树玉.产前诊断方法及其进展[J].中国优生与遗传杂志，2008，16(3):128-129.

[2]Simoni G，Brambati B，Danesino C，et al.Efficient direct chromosome analyses and enzyme determinations from chorionic villi samples in the first trimester of pregnancy[J].Hum Genet，1983，63(4):349-357.

[3]李 璞.医学遗传学[M].北京:人民卫生出版社，1989:96.

[4]孟 茜，王绪云.47例自然流产绒毛细胞培养及染色体核型分析[J].中国优生与遗传杂志，2010，18(10):33.

[5]程丽村，赵欣荣，俞 青，等.绒毛染色体检测在分析稽留流产原因中的运用[J].中国优生与遗传杂志，2006，14(2):27.