纤维堆囊菌生理生化及药敏特征

邱从平，朱建华，汤 晓，左萃花，夏梦洁

(宁波职业技术学院化工系，浙江宁波 315800)

纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)属于粘球菌目，堆囊菌亚目，堆囊菌科，堆囊菌属，在土壤中广泛分布。已知抗癌药物埃博霉素等新型活性化合物从该菌株分离提取出来。但由于纤维堆囊菌生长速度缓慢(细菌倍增时间长达16 h)，分离培养过程中易受各种杂菌污染，特别是革兰阴性菌的污染。与此同时该菌株培养时产生大量黏液，杂菌常被包裹，导致其分离纯化更加困难，获纯培养通常需1 a以上［1］。为解决这些难题已有较多尝试，如添加混合抗生素溶液或适当浓度的结晶紫［2］，添加放线菌酮［3］或多菌灵［4］，添加多菌灵辅以加热［5］，添加制霉菌素［6］或者制霉菌素与重铬酸钾混合液［7］，添加氨苄青霉素及卡那霉素［8］等方法抑制或杀灭杂菌。但是，上述文献中对纤维堆囊菌的生长规律、生理生化及耐药性特征研究较少，使该菌株的分离纯化仍以大规模重复劳动为主。本文首次对纤维堆囊菌的生理生化及耐药性特征进行了比较系统的探索研究，为寻求快速的分离筛选方法、设计高效的培养基组成、促进该菌株的研究发展和产业化应用提供了一定的参考依据。另一方面因为以16S rDNA序列确定该菌属归属时相似度很低［9］，当前仍以菌株的粘孢子、生长的菌落形态等外部特征确定其种属［10］因此，本研究也为纤维堆囊菌的分类鉴定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株DSM14627购自德国微生物菌种保藏中心，为纤维堆囊菌模式菌。

1.1.2 培养基 CNST 培养基［1］(g/L):KNO31，Na2HPO41，MgSO4·7H2O 0.2，FeCl30.01，CaCl20.1，琼脂 15，pH 7.2。

1.1.3 试剂 抗菌药物药敏试纸片(杭州微生物试剂有限公司生产)。

1.2 方法［11］

1.2.1 菌体形态观察 CNST培养基灭菌后倒入培养皿中，待冷却凝固后，贴放无菌滤纸片于培养基表面，接种于无菌滤纸片上，于28℃培养5～7 d，观察菌落和子实体，染色后对菌株显微观察。

1.2.2 生理生化实验 碳水化合物的利用以CNST培养基为基础，加入不同碳源后接种DSM14627菌，于28℃培养5～7 d观察生长情况;其他生理生化实验所涉及培养基均改用CNST培养基后参照文献进行实验。

1.2.3 药物敏感实验 在含1%微晶纤维素的固体CNST培养基上均匀涂布新鲜DSM14627菌液，适当干燥后贴上药敏纸片，每皿6片，每种药物2片，28℃培养5～7 d后测定抑菌圈直径，判定对药物的敏感度。

2 结果与分析

2.1 菌株形态与子实体的观察

图1 DSM14627子实体Fig.1 Fruiting body of DSM14627

DSM14627菌株在CNST滤纸平板上，生长早期很难观察到菌落的形成，也很少出现粘液团，但可见滤纸被分解消耗。28℃培养5 d后才开始出现子实体，通常出现在分解的滤纸的边缘，子实体呈球形，直径0.5 mm左右，显黄褐色，表面干燥，很少粘连成团块状(图1)。在光镜下观察，菌体明显为短杆状，单个排列或成群，革兰染色呈阴性，其着色程度比大肠埃希菌深，大部分细菌染成暗红色，且在菌体生长期与子实体期没有观察到明显的菌体形态方面变化(图2)。

图2 DSM14627的革兰染色Fig.2 Gram stained image of DSM14627

2.2 纤维堆囊菌碳源的利用情况

由表1可知，纤维堆囊菌只能利用少数碳源，如葡萄糖及纤维二糖，不能分解利用麦芽糖、蔗糖、D-甘露糖、D-甘露醇及D-海藻糖等碳源，说明该菌营养要求与一般细菌有所不同。因此，有报道该菌不能在牛肉膏蛋白胨这样富营养的培养基中生长繁殖［1］，其原因可能是牛肉膏蛋白胨中缺乏该菌所需的碳源或氮源。

表1 纤维堆囊菌对不同碳源的利用情况Table 1 Utilize ability of carbon Source

2.3 纤维堆囊菌的生理生化实验结果

由表2结果可知，该菌株的明胶液化、磷酸酶及β-葡萄糖苷酶的实验为阳性外，过氧化氢酶、β-木糖苷酶、尿素酶、α-半乳糖苷酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶等13项实验均为阴性。说明该菌自身酶系不发达，也许正是该菌某些酶的缺失，导致其在富营养培养基中某些营养物质在体内过量积累，产生细胞毒性，从而抑制生长。因此，寻找一个由合适的碳源、氮源及适当浓度的生长因子组成的培养基或许是该菌快速培养的关键。

表2 菌株的生理生化实验结果Table 2 Results of physiological and Biochemical Characteristics

2.4 纤维堆囊菌的药物敏感性试验结果

由表3药物敏感性试验结果可以看出，纤维堆囊菌对丙氟哌酸、万古霉素、多粘霉素B、四环素、强力霉素、美满霉素等15种抗生素敏感，对丁胺卡那霉素、卡那霉素等5抗生素中度敏感，对氨苄西林、羧苄青霉素、哌拉西林、头孢氨苄及苯唑青霉素10种抗生素有极强抗性，能在药敏试纸上生成健壮的子实体。

表3 药物敏感性试验结果Table 3 The sensitivity of the Sorangium cellulosum to test chemotherapeutants

3 讨论

通过对纤维堆囊菌DSM14627菌株的生理生化实验发现:该菌子实体呈球形，出现在分解的滤纸的边缘。菌体明显为短杆状，单个排列或成群，其营养要求与一般细菌有所不同，只能利用少数碳源，如葡萄糖及纤维二糖。试验表明:该菌自身酶系较不发达，某些酶有缺失的可能，从而导致在富营养的培养基下不能正常生长。药物敏感性试验表明，该菌属对很多抗生素有较强抗性，特别是对青霉素类药物的耐受性极强。

在利用纤维堆囊菌发酵生产活性成份时，除了注意培养基的组成外，更应该注意控制营养物质的浓度，可以对牛肉膏、蛋白胨、奶粉等富营养成份进行流加，可防止杂菌生长，及促进该菌的生长繁殖和产物合成。另一方面，在发酵培养过程中添加适当的抗生素，抑制杂菌生长。当添加的抗生素结构与活性成份结构类似时还可筛选到高产菌株，提高发酵生产率，如红霉素促进埃博霉素的合成［12］。

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