具有差向选择性还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株筛选和鉴定

盛骏桢，王亚军，罗 希，郑裕国

(浙江工业大学 生物工程研究所 生物转化与生物净化教育部工程研究中心，杭州 310014)

他汀类药物作为一类高效的降血脂药物，能够竞争性抑制羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，限制胆固醇生物合成［1］，是全球销量最高的降血脂药物［2］。作为合成阿托伐他汀药效基团的关键手性中间体，6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯的合成是生产阿托伐他汀的关键技术［3］。化学法合成6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯存在能耗大、溶剂消耗高和产物光学纯度低等缺陷，利用生物催化的高效率、高立体选择性和环境友好等特性，开发6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯手性生物合成技术具有重要的意义，也逐渐成为研究热点［4－5］。

羰基还原酶在生物催化反应中具有空间选择性的特点，因而为生物催化还原酮酯制备光学纯β－羟基酯提供了一条有效的途径［6］。然而，在立体化学方面大多数天然羰基还原酶催化的非对称还原大多遵守Prelog法则，具有反Prelog法则的羰基还原酶相对较少，反Prelog法则立体选择性酶的精确机理也尚未解析［7－8］。笔者所在课题组成功筛选得到具有非对映选择性还原 (R)－6－氰基－5－羟基 －3－羰基己酸叔丁酯活性的菌株 ZJB－09225，对其进行菌种鉴定，并研究其催化性能，以建立6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯的生物催化合成工艺(图1)。

图1 羰基还原酶不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯Fig.1 Enzymatic conversion of t-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxy-3-oxohexanoate to t-butyl 6-cyano-(3R，5R)-dihydroxyhexanoate by ketoreductase.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂

6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯标准品购自Toronto化学制品研究公司，(R)－6－氰基－5－羟基 －3－羰基己酸叔丁酯(质量分数约73.5%)由浙江新东港药业股份有限公司馈赠。麦芽浸粉和琼脂为市售生化材料。其他化学试剂均为市售色谱纯或分析纯试剂。

2，4－二硝基苯肼溶液:称取0.60 g 2，4－二硝基苯肼，溶解于15.0 mL浓H2SO4。充分溶解后，与90.0 mL 73.9%乙醇水溶液混合，加水定容至100.0 mL，即为6.0 g/L 2，4－二硝基苯肼溶液。

1.1.2 培养基组成

富集培养基:豆芽汁培养基(50.0 g葡萄糖，黄豆芽100.0 g煮沸30 min，过滤后加水补足至1.0 L，pH自然)，灭菌后加入22.8 g(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯。

斜面与平板培养基:豆芽汁培养基(50.0 g葡萄糖，黄豆芽100.0 g煮沸30 min，过滤后加水补足至1.0 L，pH自然)，琼脂质量浓度为20.0 g/L。

发酵培养基(1 L):麦芽浸粉30.0，葡萄糖20.0，(NH4)2HPO41.0，K2HPO4·3H202.28，NaCl 1.0，CuSO43.0 mg;pH 7.0。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株筛选

土样采集自江浙一带的果园、食品厂及制药厂等地。称取 1.0 g土样，分散到 10.0 mL、0.85%生理盐水溶液中，充分混匀;移取1.0 mL菌悬液接种至29.0 mL含100 mmol/L(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯富集培养基;在28℃、150 r/min条件下，摇床振荡培养至培养液变浑浊;按照体积分数3.0%接种量转接到新鲜的无菌富集培养基中，继续在28℃、150 r/min条件下摇床振荡培养至培养液浑浊。连续富集3次后对富集培养物逐级稀释、涂布到固体平板上，30℃培养至形成明显的单菌落。将平板上形成的单菌落通过无菌牙签接种到无菌豆芽汁培养基中。30℃、150 r/min条件下培养2 d，收集发酵液。各取0.75 mL菌液与等体积30%(体积分数)甘油于EP管内混合，－20℃保藏。

移取20.0 mL发酵液，12000 r/min离心，收集菌体并用生理盐水洗涤2次。细胞分散于10.0 mL、pH 7.0磷酸缓冲液(50.0 mmol/L)中，加入0.10 g(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯，充分混合后置于30℃水浴摇床，反应24 h。转化液12000 r/min离心5 min，上清液采用0.45 μm微滤膜过滤，滤液采用2，4－二硝基苯肼法［9］、HPLC分析，计算各株菌的羰基还原酶活性。

1.2.2 菌体生理生化及分子鉴定

利用Vetik 2 Compact自动微生物鉴定系统，考察菌株对46种鉴定试验的鉴定结果。将菌株接种到酵母平板培养基，30℃恒温培养2 d，用无菌棉签拭转移形态相似菌落至无菌水中，利用浊度计调节菌悬液浊度至1.8～2.2麦氏单位。移取菌悬液至鉴定卡，培养18 h后置于 Vetik 2自动微生物鉴定系统分析。

分子鉴定首先提取ZJB－09225的基因组DNA。利用引物pITS1:5'－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3'和 pITS4:5'－ TCCTCCGCTTATTGATATGC －3'，在PCR仪PTC－200(Bio-Rad，USA)进行扩增，条件如下:95℃ 4 min;94℃ 50 s，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35个循环;72℃ 10 min。扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA。根据T/A克隆步骤(Takara，日本)，将得到的目的基因与pMD18－T载体连接［10］。获得的重组质粒导入感受态E.coli JM109［11］，然后接种在含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上培养，阳性克隆标记为E.coli JM109/pMD18－T－ZJB－09225。E.coli JM109/pMD18－T－ZJB－09225接种在含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃过夜培养，收集菌体，采用AxyPrep质粒DNA试剂盒提取质粒，测序，并与GenBank中的基因序列进行对比。18S rDNA全序列用 CLUSTAL W ver.1.81 A 软件包排序，使用MEGA version 2.1软件计算进化距离，利用Neighour-Joining法构建系统发育树。

1.2.3 转化条件

取1.0 g P.caribbic ZJB－09225细胞分散于10.0 mL含20.0 g/L葡萄糖酸钠的磷酸缓冲液(pH 7.0，50 mmol/L)中，加入(R)－6－氰基 －5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯(终质量浓度14.0 g/L)。混匀后于30℃反应3 h。转化液12000 r/min离心10 min，上清液经0.45 μm微滤膜过滤。取澄清滤液测定生成的6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯浓度和残余(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯浓度。

1.2.4 高底物浓度下的转化条件

取10.0 g P.caribbic ZJB－09225细胞分散于100.0 mL含20.0 g/L葡萄糖酸钠的磷酸缓冲液(pH7.5，50 mmol/L)中，加入50 g/L(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯。混匀后于磁力搅拌锅内反应12 h，温度35℃，转速300 r/min。每小时取样 0.8 mL，加入 100.0 μL 1.0 mol/L HCl终止反应，然后再加入100 μL 1.0 mol/L NaOH溶液中和，12000 r/min离心10 min。上清液经0.45 μm微滤膜过滤，滤液采用HPLC检测生成的6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯浓度和残余的(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯浓度。

1.2.5 2，4 － 二硝基苯肼显色法

根据2，4－二硝基苯肼显色法工作原理［9］，绘制(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯工作曲线。取 20.0 μL转化后的澄清滤液，与100.0 μL 2，4－二硝基苯肼溶液充分混合并静置1 h，加入5.0 mL 0.8 mol/L NaOH，混匀后静置 15 min。采用酶标仪测定样品在450 nm下的吸光值，计算出样品中残余(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯的浓度。

1.2.6 液相分析方法

6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯及其非对映异构体用LC－20AD型高效液相色谱仪(岛津)检测。色谱条件:液相色谱柱选择大连依利特Hypersil ODS2 C18 柱 (4.6 mm ×250 mm，2.5 μm)，流动相为 V(乙腈)∶V(水)=1∶3，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃。

产物6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯d.e.值按式(1)计算。

式中:A(3R，5R)表示产物6－ 氰基 －(3R，5R)－ 二羟基己酸叔丁酯的峰面积，A(3S，5R)为6－氰基－(3S，5R)－二羟基己酸叔丁酯的峰面积。

得率Y按式(2)计算。

式中:c0表示(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯的起始浓度，mol/L;V0为起始时反应体系体积，L;cP为反应生成 产物6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯的浓度，mol/L;V为反应后反应体系体积，L。

2 结果与讨论

2.1 筛选结果

采用显色法进行R－羰基还原酶菌株筛选，结果如图2所示。由图2可知:筛选获得的多株菌株中，菌株ZJB－09225作用于(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯的羰基还原酶活力最好，24 h转化后残余(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯较少。通过HPLC分析检测，ZJB－09225菌株还原生成的6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯的量最高且立体选择性较好，产物构型符合反Prelog法则。

图2 显色法筛选非对映选择性还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性菌株示意Fig.2 Screening strains with diastereoselective ketoreductase activity towards t-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxohexanoate using colorimetric reaction

2.2 菌种鉴定结果

菌株ZJB－09225细胞呈卵圆状，细胞大小1.5 μm×2.5 μm。在豆芽汁平板上培养2 d，形成圆形、乳白色、不透明、中间凸起、表面光滑的菌落，直径约3 mm(图3)。

图3 菌落ZJB-09225在豆芽汁平板上的菌落形态Fig.3 Morphological characteristics of strain ZJB-09225

ZJB－09225生理生化鉴定结果示于表1。菌株ZJB－09225对其中的33种鉴定指标显示阳性反应，对其他13种鉴定指标显示阴性反应(表1)。基于Vetik 2 Compact自动鉴定系统分析结果，菌株ZJB－09225与Pichia caribbic A标准菌株相似，相似性指数为0.980。

表1 利用Vitek 2 Compact微生物自动鉴定系统分析菌种ZJB-09225碳/氮源利用结果Table 1 Utilization of carbon and nitrogen sources by strain ZJB-09225 detected with Vitek 2 Compact system

提取菌株ZJB－09225的18S rDNA测序。从GenBank中挑选与ZJB－0922518S rDNA序列相似的序列，采用MegAlign软件(DNAStar公司，美国)绘制进化树(图4)。将获得的序列与GenBank中保存的数据进行相似性分析发现，菌株ZJB－09225与Pichia caribbic(FN.428931.1)同源性最高 (100%，607 bps，18S rDNA)。因此，本实验鉴定的微生物属于Pichia属的caribbic种。结合生理生化与18S rDNA分子鉴定，菌株ZJB－09225被鉴定属于Pichia caribbic，已递交CCTCC保藏，保藏号CCTCC M 2012411。

图4 菌株ZJB-09225系统进化发育树Fig.4 Phylogenetic dendrogram for strain ZJB-09225 and related strains based on 18S rDNA sequence

2.3 发酵时间对P.caribbic ZJB－09225细胞羰基还原酶活性的影响

将P.caribbic ZJB－09225接种于发酵培养基，每隔4 h取样分析发酵液羰基还原酶活性，结果见图5。由图5可知:培养时间显著影响 P.caribbic ZJB－09225羰基还原酶体积酶活和生物量，培养32 h后，P.caribbic ZJB－09225发酵液体积酶活达到峰值，约7.2 U/L，生物量为8.8 g/L。

图5 P.caribbic ZJB-09225发酵进程曲线Fig.5 Profiles of biomass density，volumetric activity during P.caribbic ZJB-09225 culture

2.4 温度和pH对P.caribbic ZJB－09225细胞羰基还原酶活性的影响

温度、pH对P.caribbic ZJB－09225细胞羰基还原酶活性的影响见图6。由图6(a)可知，在转化pH7.0、转化温度 28 ～37 ℃范围内，P.caribbic ZJB－09225细胞表现出较好的差向选择性，产物d.e.值在95%左右;35℃时P.caribbic ZJB－09225细胞羰基还原酶活力达到最高，温度超过37℃时，细胞活性急剧下降。由图6(b)可知:在35℃、pH 6.0～8.0范围内，P.caribbic ZJB－09225细胞羰基还原酶具有较高的活性和立体选择性，在pH 7.5磷酸缓冲液中P.caribbic ZJB－09225细胞羰基还原酶活力最高 (图6(b))。因此，P.caribbic ZJB－09225细胞的最适作用温度为35℃，最适作用pH为7.5。

图6 转化温度和pH对P.caribbic ZJB-09225细胞羰基还原酶活性的影响Fig.6 Temperature and pH dependence of P.caribbic ZJB-09225 ketoreductase

2.5 P.caribbic ZJB－09225立体选择性还原高浓度6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯

P.caribbic ZJB－09225立体选择性还原 50.0 g/L(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯的进程曲线见图7。由图7可知:转化3 h，产物6－氰基 －(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯得率为3.4%，产物d.e.值99.5%以上，几乎检测不到反式6－氰基－(3，5)－二羟基己酸叔丁酯形成。转化12 h后，产物6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯得率达19.4%，产物d.e.值94.3%，提高(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯转化率导致6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯d.e.值降低。

图7 P.caribbic ZJB-09225还原生成6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸叔丁酯的反应进程曲线Fig.7 Time course of 6-cyano-(3R，5R)-dihydroxylhexanoate formation catalyzed by P.caribbic ZJB-09225

3 结论

从土壤中筛选得到具有不对称还原6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯的羰基还原酶菌株ZJB－09225。经过生理生化和分子遗传学鉴定，确定该菌株属于Pichia caribbic。P.caribbic ZJB－09225发酵32 h后羰基还原酶活性达到最高值，体积酶活约7.2 U/L，P.caribbic ZJB －09225 生物量密度 8.8 g/L。P.caribbic ZJB－09225对(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯的最佳作用条件为35℃、pH 7.5;在转化率3.4%以内，产物d.e.值99.5%以上。利用P.caribbic ZJB－09225细胞成功建立了光学纯6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯的生物催化合成工艺，丰富了他汀药物关键手性侧链的合成技术。首次报道了P.caribbic不对称还原(R)－6－氰基－5－羟基－3－羰基己酸叔丁酯制备6－氰基－(3R，5R)－二羟基己酸叔丁酯，后续P.caribbic ZJB－09225羰基还原酶纯化、基因克隆具有重要的研究价值。

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