从光肩星天牛活体虫中分离球孢白僵菌及其无纺布菌条生产

蒲顺昌，刘玉军，葛永斌，郭 慧

1.亳州师范高等专科学校理化系，安徽亳州，236800；2.安徽农业大学安徽省微生物防治重点实验室，安徽合肥，230036

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)隶属于昆虫纲(Insecta)，鞘翅目(Coleoptera)，天牛科(Cerambyeidae)，沟胫天牛亚科(Lamiinae)，星天牛属(Anoplophora)[1]，是我国杨树、柳树等多种阔叶树种的重要蛀干害虫，是天牛科中发生较早的种类，分布于全国25个省、自治区，现已扩展到世界多地[2-3]。柳树是蚌埠市淮河堤坝的主要绿化树种，但近年来受到光肩星天牛的严重危害，局部地区虫口密度较大，危害面积有迅速扩大之势，严重影响了柳树的正常生长。

昆虫病原真菌具有不污染环境、易流行、容易大量生产等优点[4]。球孢白僵菌Beauveriabassiana是昆虫病原真菌中应用最为广泛的种类，据记载，该菌能侵染700余种昆虫[5]。无纺布菌条是利用无纺布为载体，让虫生真菌在其上生长，当害虫在接触无纺布上的孢子后即会受到侵染致死，从而达到防治害虫的目的。徐金柱等研究表明，无纺布菌条能够维持林间较高的带菌量，并持久发挥作用[6]。为探讨利用白僵菌防治光肩星天牛的有效途径，本研究对从光肩星天牛活体虫中分离的球孢白僵菌进行无纺布菌条的生产和检测，为防治光肩星天牛提供新的技术。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从蚌埠市淮河护堤柳树林中采集光肩星天牛成虫，并室内饲养。经过室内分离鉴定，获得10株球孢白僵菌菌株。

1.2 培养基

PPDA培养基(成分为马铃薯200 g，葡萄糖30 g，琼脂20 g，酵母10 g，水1 000 mL)。SDAY培养基(成分为葡萄糖40 g，琼脂20 g，酵母10 g，蛋白胨10 g，水1 000 mL)。

1.3 标本分离与培养

将采集的昆虫样品用灭菌水冲洗3次后，放入0.1% 的升汞溶液中浸泡1 min，然后再用无菌水清洗3次。把经表面消毒的虫体，放入灭菌小塑料杯(25±1)℃保湿培养。为防止其他杂菌污染，将虫体培养长出的真菌菌丝挑入含燕麦片(35 g)、琼脂(5 g)、结晶紫(5 mg)、多果定可湿性粉(0.9 g)、青霉素(0.4 g)、盐酸链霉素(1 g)、水(1 000 mL)的选择性培养基中进行培养。

1.4 标本鉴定

观察分离纯化的菌株，记录菌落的色泽、形态、生长速度等培养性状，挑取少许菌株初产孢的培养物，用水溶液制成临时玻片，在显微镜下观察各菌株的产孢结构及孢子形状与大小。

1.5 无纺布菌条的培养制作及质量检测

1.5.1 无纺布菌条的培养制作

无纺布菌条的生产参照胡家付等[7]的方法。

1.5.2 含孢量的测定

任意抽取培养好的9条球孢白僵菌无纺布菌条，每3条为一组，分别为1组、2组和3组，在其上各剪下约1 cm2菌条，每条设3个重复。用无菌水将菌条上的分生孢子冲下，然后在高速分散器下分散10～15 min。用血球计数板在显微镜下计数，统计菌条上的平均产孢量。

1.5.3 孢子萌发率的测定

将上述孢悬液分别配成1.0×106个孢子/mL的孢悬液，然后接种于水琼脂载玻片上，每个处理3个重复。放入(25±1)℃光照培养箱内培养24 h后检查其萌发率，统计出菌条上孢子平均萌发率。

1.5.4 含水率的测定

使用烘干法测定菌条含水率：从培养好的球孢白僵菌无纺布菌条中任意抽取9条，每3条为一组，在其上各剪下3小块，放入120℃烘箱中烘1 h，比较烘干前后的重量，计算无纺布菌条的含水量。

1.6 数据处理

试验数据应用SPSS18.0数据处理系统进行统计分析，试验结果经方差分析后进行Duncan's多重比较检验各处理间的差异显著性(P=0.05)。

2 结果与分析

2.1 光肩星天牛活体成虫病原微生物的鉴定

经室内分离培养，在自然状况下，光肩星天牛感染病原微生物全部为球孢白僵菌，其形态特征如下：

球孢白僵菌在PPDA平板上(25±1)℃下培养14 d后，菌落生长较快，直径达到4.5～5.0 cm。染菌虫尸初为白色绒毛状，后产生大量淡黄色粉状分生孢子。分生孢子梗多着生于营养菌丝上，分生孢子浓密簇生分生孢子梗上，球形至瓶形，颈部轴上具明显的“之”字形弯曲，在分生孢子梗或菌丝上聚成紧密的孢子头。分生孢子呈球形或近球形，透明并且光滑，2.0～3.0×1.6～2.5 μm。

2.2 白僵菌无纺布制剂的含孢量及活孢率的测定

按照前述方法制作无纺布制剂，干燥后进行质量检验。随机检测白僵菌无纺布菌条含孢量，无纺布制剂的平均产孢量可达3.02×108个/cm2。Duncan极差分析显示，各随机样品之间差异不显著。对无纺布菌条活孢率进行检测，其菌条活孢率平均达到96.66%，各样品间差异也不显著(表1)。

2.3 白僵菌无纺布制剂含水率的测定

无纺布在保存期间要求较低的含水率，一般白僵菌菌条含水率在8%～10%之间。本研究检测白僵菌无纺布制剂含水率为9.08%(表1)，达到无纺布制剂质量标准，且有利于无纺布菌条的长期存储。

表1 白僵菌无纺布菌条的产孢量、活孢率及含水量测定

注：表中数据表示平均值±标准差；字母表示0.05水平上的差异显著水平。

3 讨 论

无纺布菌条具有极强的吸湿能力，能够吸收大量的培养基营养成分，并在自然界自然降解，可以有效地改善白僵菌孢子生存环境，提高抵抗林间不良环境的能力，并可以在环境适宜的条件下促进孢子的再次萌发、增加林间的带菌量，以达到长期持续控制害虫的目的[8]。Shimazu等[9]用培养有球孢白僵菌的无纺布菌条防治松褐天牛的幼虫获得了成功。目前，本研究制作的白僵菌无纺布菌条平均产孢量可达3.02×108个/cm2，经菌条活孢率和含水量检测，其菌条平均活孢率达到96.66%，含水量仅为9.08%，且各样品间差异不显著，可以达到野外防治的要求。

在野外调查过程中，并没有发现感病的光肩星天牛僵虫，所采集的光肩星天牛活虫体是在室内饲养过程中被白僵菌感染致死的，说明光肩星天牛在野外已经感染球孢白僵菌。显然，室内适宜的环境条件，有利于白僵菌表现出症状。这表明本研究的球孢白僵菌在光肩星天牛种群中存在潜伏侵染现象。黄运霞等[10]从广西全境各经纬线上采集活虫样品,分离虫生真菌，结果表明，在所采集的活虫样品3 764份中，有虫生真菌样品334份，其平均检出率为8.9%。表明虫生真菌的潜伏侵染在自然界是非常普遍的现象，而且还可以通过寄主转移，在林间宿存[11]。

从无纺布菌条的应用方式来说，采用在每棵树上均放置无纺布菌条的淹没式的放菌方式，虽然可以取得一定的防治效果，且比较易于在山高坡陡灌丛密的森林中大面积应用，但成本较高；而采用点状的接种式放菌则是切实可行的[8]。为提高无纺布的防治效果，利用引诱剂结合无纺布菌条防治天牛类害虫具有诱人的前景[9,12]。近年来，松褐天牛引诱剂和白僵菌结合使用已非常广泛[13]。通过引诱剂的引诱聚集作用，增加昆虫与球孢白僵菌孢子的接触机会而提高天牛的感染率，同时也可增加林间的带菌量。但至今还没有光肩星天牛引诱剂的问世，下一步还需要进行光肩星天牛高毒力菌株的筛选和引诱剂的开发，以便寻找简便、有效、适用林间操作的防治方法，只有这样，才能有效控制光肩星天牛的危害。

参考文献：

[1]邵景文．森林昆虫分类与鉴定[M]．北京：中国林业出版社，1996：163-168

[2]章士美，赵永祥．中国农林昆虫地理分布[M]．北京：中国农业出版社，1996：151-151

[3]吴蔚文，蒋书楠．中国的光肩星天牛类群[J]．昆虫学报，1998，41(3)：284-290

[4]Francisco P,Fernando E V.Inoculation and colonization of coffee seedlings(Coffea arabica L)with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Ascomycota:Hypocre-ales)[J].Mycoscience,2006,47(5):284-289

[5]蒲蛰龙，李增智．昆虫真菌学[M]．合肥：安徽科技出版社，1996：1-715

[6]徐金柱，樊美珍，李增智．放菌方式对白僵菌防治光肩星天牛效果的影响[J]．中国生物防治，2003，19(1)：27-30

[7]胡加付，李农昌，李增智，等．白僵菌无纺布菌条生产技术的研究[J]．中国森林病虫，2003，22(3)：1-3

[8]王滨．白僵菌持续控制马尾松毛虫的生物多样性和生态学基础[D]．杭州：浙江大学农业与生物技术学院，2003：29-42

[9]Shimazu M,Tsuchiya D,Sato H,et al.Microbial control of Monochamus alternatus Hope(Coleoptera:Cerambycidae)by application of non-woven fabric strips with Beauveria bassiana(Deuteromycotina:Hyphomycetes)on infested tree trunks[J].Applied Entomology and Zoology,1995,30(1):207-213

[10]黄运霞，黄荣瑞.从活虫体样品中分离虫生真菌初探[J]．中国生物防治，1995，11(4)：165-167

[11]丁德贵，李增智，樊美珍，等.球孢白僵菌种群在松林中的寄主转移及遗传多样性对松毛虫持续控制的影响[J].应用生态学报，2004，15(12)：2315-2320

[12]王滨，樊美珍，李增智．白僵菌无纺布结合引诱剂防治鞘翅目林业害虫研究初报[J]．中国生物防治，2003，19(2)：91-92

[13]王四宝．白僵菌与引诱剂联合控制松褐天牛及白僵菌分子生态学研究[D].上海:中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 2006：50-61