小RNA的组成和功能——三类内源小RNA的研究概况

李泽 白荷露

（1.呼和浩特职业学院生物化学工程学院，呼和浩特 010051；2.复旦大学生命科学学院，上海 200433）

生物体中RNA可以分成两大类：编码RNA和非编码RNA。非编码RNA中有许多种小RNA，它们组成了细胞中高度复杂的RNA调控网络，在调节个体发育、细胞增殖分化、肿瘤的发生发展及抗病毒等整个细胞水平的几乎所有事件中起着重要的调控作用。

在20世纪90年代，生物学家相继在植物和动物中发现了正反义双链小RNA导致的内源基因沉默的现象。Fire等［1］对这种dsRNA调控内源基因表达的现象定义了一个名词——RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）。随后，在线虫、果蝇和拟南芥等多种模式生物中发现RNAi现象，RNAi作用机制模型被提出［2］，并且应用RNAi技术成功诱导哺乳动物细胞基因沉默现象等研究成果相继有论文发表［3］，使RNAi技术在2002年度《Science》评选的十大科学成就中名列榜首。自此，RNAi研究已成为分子生物学领域最为热门的方向之一。RNAi现象是由生物体内一类非编码的双链小RNA所指导，内源小RNA种类各异，主要可归纳为3类：微小RNA（microRNA，miRNA），小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）和与piwi相互作用的RNA（piRNA）。关于miRNA和siRNA的研究起步较早，研究也较为深入，piRNA自2006年发现后又一次掀起了小RNA研究的热潮。

1 miRNA的研究

1.1 miRNA的结构特征

人们最早发现的miRNA是线虫中的lin-4和Let-7［4，5］，由于它们在发育时序的控制中发挥重要作用，因此其最初被称为小分子时序RNA（small temporal RNA，stRNA）。随后，科研人员相继在线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥和水稻等模式生物和细胞中克隆了上百种类似的非编码小RNA分子，有些并不是在特定阶段表达，而是在特定的细胞类型中表达，统称为microRNA。

miRNA是一类长度约22 nt的非编码单链小分子RNA，由一段具有发夹结构的70-80 nt单链RNA前体（pre-miRNA）剪切后生成。它通过与目标mRNA分子的3'端非编码区域（3'-untranslated region，3'UTR）互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。miRNA具有以下结构特征：成熟miRNA的5'端磷酸基团或3' 端羟基可以和上游或下游的序列不完全配对形成茎环结构；大部分miRNA从前体的一条臂上剪切而来，只有少数是两条臂同时剪切产生；miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中而且绝大部分位于基因间隔区；miRNA在各物种间具高度的进化保守性，尤其在茎部结构，表明miRNA各自行使着重要的生物学功能；miRNA具一定的阶段性和组织特异性，即在生物发育的不同阶段或不同组织中表达不同类型的miRNA［6］。

1.2 miRNA的生物发生过程

整个miRNA的生物发生过程贯彻细胞核和细胞质，包括pre-miRNA的产生、输出以及成熟miRNA的生成［7］。细胞核内的miRNA基因在RNA pol II的作用下转录成pri-miRNA。pri-miRNA被RNase Ш Drosha剪切成约70 nt的茎环结构前体——pre-miRNA。pre-miRNA借助转运蛋白Exportin-5从核内运输到胞质中，在另一种RNase Ш Dicer作用下被剪切成约22 nt的双链miRNA中间体，即miRNA：miRNA*（miRNA*是miRNA的 互 补 序列）的双螺旋结构。随后双螺旋解旋，其中一条链结合到RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）中形成非对称RISC复合物（asymmetric RISC assembly）［8］，该复合物能结合到靶mRNA上，从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。

植物miRNA的成熟过程与动物miRNA的成熟过程的不同之处在于植物中没有Drosha的同源类似物）。在植物中，miRNA的成熟是在Dicer同源异形体DCL1催化下进行的，与Drosha功能类似的酶催化pri-miRNA 转变成pre-miRNA，然后在DCL1和其他类似蛋白的作用下，通过对pre-miRNA 茎环结构的剪切，在细胞核内生成中间产物miRNA：miRNA* 双链。在类似Exportin-5功能的HAST-Y协助下输出细胞核进入细胞质。最后，经过解旋酶的作用成为单链的成熟miRNA［6］（图1）。

1.3 miRNA的作用机制和功能

miRNA能够通过两种沉默机制调控目的基因的表达：mRNA的切割或翻译抑制。如果miRNA与mRNA完全互补，miRNA指导mRNA特异性切割；若不完全互补则指导翻译抑制［6］（图2）。研究发现，对于动物而言，miRNA能够与靶mRNA的3'-UTR不完全配对，从而抑制了该基因的翻译过程。对于大多数植物，miRNA能与mRNA的开放阅读框完全互补配对，从而对mRNA进行剪切，使mRNA降解［9］。

研究发现，许多植物miRNA参与了植物发育进程的调控。对拟南芥中的miRNA进行靶基因预测后，发现近70%的靶基因是参与发育调控与细胞分化的基因家族成员，植物miRNA正是通过使特定细胞中这些基因的转录产物降解从而改变植物形态［10］。

动物miRNA在生物体许多生理过程中起着重要的调节作用，如胚胎发育，细胞分化、增殖、凋亡，胰岛素分泌等过程。近年来研究显示，miRNA甚至会与一些疾病的形成有关［11-13］。据估计，人类基因组中miRNA基因的数目可能多于总基因数的1%，根据miRNA种子序列分析推测人类基因组中约30%的基因受miRNA调控。表1和表2分别列出了动物中一些已知功能的miRNA［6］和靶分子已知但功能尚不明确的的miRNA［7，10］。

2 siRNA的研究

siRNA也是一种长度为21-25 nt的小RNA，其中包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂，在RNA沉默过程中起中心作用，诱导特定mRNA的降解，这个过程被称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）［14］。虽然siRNA和miRNA非常相似，但是它们的产生途径、功能以及对靶RNA的作用都是不同的。下面以列表的形式介绍了siRNA和miRNA的主要区别［7］（表3）。图1和图2阐明了siRNA和miRNA生物发生及作用机制的区别［10］。

图1 miRNA和siRNA的生物发生过程［6］

图2 miRNA和siRNA的作用机制［6］

大多数真核生物中都有各种不同类型的小RNA，以模式植物拟南芥为例。拟南芥的siRNA特别复杂，它含有3种不同于miRNA的内源siRNA亚 类：反 式 作 用siRNA（trans-acting siRNAs，tasiRNA），从天然反义转录产物衍生的siRNA（natural siRNAs，nat-siRNA），与重复序列结合的siRNA（repeat-associated siRNAs，ra-siRNA）。这3种 小RNA都选择性地与AGO复合物结合。miRNA从不完整的发夹结构产生，DCL1对发夹的切割通常产生与AGO1结合的小RNA。ta-siRNA的生物合成需要有miRNA介导的非编码转录产物的切割，再由RNA聚合酶6合成dsRNA，最后由DCL4加工形成可与AGO2结合的21核苷酸小RNA。nat-siRNA由天然反义转录产物产生，这种转录产物由两个重叠基因的汇集转录产生，由DCL2和DCL1加工。拟南芥中最丰富的小RNA是长度为24核苷酸的ra-siRNA，由转座子和其他重复序列产生，主要与AGO4结合［15］。

表1 已知功能的miRNAs

表2 部分靶分子已知但功能尚不明确的miRNA

2007年初发表于《Science》的两篇关于siRNA的研究文章中提出了次级siRNA（secondary siRNA）是一种特殊的小RNA群体［16，17］。研究人员发现，几个次级siRNA序列开始于一些初级siRNA下游核苷，在表达错配单核苷酸初级siRNA的细胞系中并不复制这种错配，但是包含mRNA互补核苷。次级siRNA是唯一携带5'双磷酸盐和三磷酸盐，具有反应链极性（antisense polarity）的siRNA，也是唯一与RDE-1（RNAi特异性argonaute蛋白）相关联的siRNA。因此研究人员推断次级siRNA是一种不同类型的小RNAs，其产生依赖于RdRP。

表3 siRNA和miRNA的主要区别

3 piwiRNA的研究

2006年7月，《Nature》和《Science》杂志几乎同时报道了一类新的非编码小RNA——piRNA（Piwiinteracting RNA），发现它们与生殖细胞发育密切相关［18-20］。piRNA是从哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类长度约30 nt的单链小RNA，与miRNA和rasiRNA一样，5'端也具有强烈的尿嘧啶倾向性（约86%），但是piRNA以高度特异链的方式主要对应于单链基因组位点。piRNA的表达具有组织特异性，调控着生殖细胞和干细胞的生长发育，目前只在老鼠、果蝇和斑马鱼等哺乳动物的生殖细胞中发现了这类小分子。piRNA在染色体上的分布极不均匀，主要存在于基因间隔区，成簇分布在1-100 kb相对较短的基因组位点，几乎都具有同一取向，说明同一簇piRNA可能来源于同一初始转录物，但有一部分成簇的piRNA会突然改变取向，说明这些双向的成簇piRNA可能由相同的启动子按不同的方式转录。

piRNA的来源一直是研究人员的研究重点之一。piRNA的生物发生途径明显不同于miRNA和siRNA。研究人员提出了几种可能的piRNA生源论机制和模型，但是目前的研究还不足以充分解释piRNA的生物发生过程，尚需进一步的研究。

目前的研究表明，piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中，通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物（piRC）调控基因沉默途径，piRC在配子发生过程中起着十分重要的作用。另外，只有17%-20%的哺乳动物piRNA对应于标记的重复序列，包括转座子和逆转录转座子。因此，piRNA从后生程序化和抑制转录到转录后调控可能有不同的功能。根据Piwi蛋白已知的功能推测piRNA的功能有3个方面：沉默转录基因过程；维持生殖系和干细胞功能；调节翻译和mRNA的稳定性［21］。

piRNA的发现为非编码小分子RNA的研究开辟了一个新领域。到目前为止，对piRNA的研究已经取得了阶段性的成果，但要预测piRNA在生物医学上的应用还为时过早，其中仍然有许多问题需要进一步研讨。

4 小结

从小RNA发现至今，人类对其结构和功能已有了一定程度的了解，并将其应用于基础科学和应用科学的研究中。尤其是以siRNA为中心的RNAi技术已应用于功能基因研究，基因治疗和药物开发等多方面，在HIV感染，肝炎病毒感染及肿瘤等疾病治疗中已取得突破性进展。因此，人们认识到基因组中大量的非编码区蕴藏着重要的生命功能活动信息，生物体的一些生长发育，细胞的发生和分化，疾病的产生等都被这些非蛋白编码的小RNA所调控。目前人类所了解的小RNA只是全部小RNA的冰山一角。毫无疑问，细胞中还有大量的非编码RNA未被发现，许多已发现的小RNA 的功能还有待进一步探索，它们将是生命科学领域里新的研究热点。对包括miRNA 在内的所有小分子RNA的深入研究将有助于人类揭示更多生命的奥秘。

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