microRNA 与骨肉瘤的研究进展

赵晓蕾 蔡 林 邓洲铭

microRNA 与骨肉瘤的研究进展

赵晓蕾 蔡 林 邓洲铭

骨肉瘤是好发于儿童和青少年的骨恶性肿瘤，它的第二个好发高峰是在 70～80 岁的老年人[1]。在美国，每年新发的骨肉瘤患者约为 900 例[2]。美国癌症中心的数据显示，骨肉瘤患者的 5 年生存率约为 53.9%[3]。新辅助化疗的应用使得骨肉瘤的 5 年生存率有了明显提高，但是仍有一部分患者对化疗不敏感，同时肿瘤的复发和转移一直是治疗的难题。虽然骨肉瘤相对于其它肿瘤而言较为少见，但是由于它的高致死率和致残率，有关骨肉瘤的基础研究和临床治疗策略一直是医学界的研究热点。之前的研究已经发现骨肉瘤细胞中存在多种遗传学改变，包括染色体结构的异常、缺失等以及肿瘤抑制基因的突变。DNA 的甲基化等表观遗传学的改变也会导致骨肉瘤的发生。尽管有关骨肉瘤的基础研究层出不穷，但是有关 microRNAs ( miRNAs ) 在骨肉瘤的发生和发展过程中所起的作用仍不是十分明确[4]。

miRNAs 是一类长约 22 核苷酸的非编码的单链 RNA分子，它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中[5]。1993 年，科学家们首次在线虫中发现了 miRNA[6-7]，目前在哺乳动物中确认的 miRNA 数目已经成千上万个[8]。以往的研究认为 miRNA 通过与靶 mRNA 形成不完成互补双链来阻遏翻译，但 2006 年 Wu 等[9]的研究发现 miRNA 与靶蛋白不完全互补后，除了阻遏翻译外还可以引起 mRNA快速脱腺苷酸化而被降解以抑制基因的表达。随着研究的不断深入，人们发现 miRNA 在许多生物学过程中都发挥着重要作用，包括细胞周期的调控、细胞的生长与分化、凋亡以及胚胎发育等等[8]。miRNA 与肿瘤发生发展的关系也是生命科学研究的热点，研究者发现 miRNA 在骨肉瘤的发生发展过程中起着重要作用[10]。本研究将近年来miRNA 与骨肉瘤的研究进展综述如下。

骨肉瘤中差异性表达的 miRNA

以往认为骨肉瘤主要来源于分化异常的成骨细胞，但是最近的研究认为骨肉瘤可能起源于多能干细胞 ( 间质干细胞 )。间质干细胞在向成骨细胞分化的过程中发生遗传学的改变，从而分化为异常的骨肉瘤细胞[11]。目前在其它肿瘤中，已有研究提示 miRNA 可能通过参与调节肿瘤干细胞的分化过程从而导致肿瘤的发生，但是这一机制在骨肉瘤发生中的作用尚不清楚[12]。miRNA 的异常表达在肿瘤的发生中起着重要作用，更重要的是肿瘤的 miRNA 表达谱具有高度特异性，相对于 mRNA 表达谱确定肿瘤的分类更具有意义，可以作为诊断肿瘤的新技术手段[13]。Sarver 等[14]对代表 22 个不同病理类型的肉瘤的 300 个标本 ( 包括 15 个骨肉瘤标本 ) 的 miRNA 表达谱进行了聚类分析，发现与其它肉瘤 ( 如滑膜肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、恶性纤维组织细胞瘤 ) 相比，骨肉瘤的 miRNA 表达谱具有明显的特异性[14]。研究发现 miRNA 通过直接或者间接地与靶蛋白结合从而发挥癌基因或者抑癌基因的作用。例如，miR-373 能够通过抑制 p53 通路的信号传导，从而促进肿瘤的发生，而 let-7 和 miR-98 可以通过下调Ras 和 Myc 癌基因的表达从而抑制肿瘤的发生[15]。多项研究采用 miRNA 表达谱技术对 miRNA 的在骨肉瘤中的差异性表达进行了分析[4,10,16-18]。

Jones 等[10]使用 miRNA 芯片检测 18 例骨肉瘤标本与正常骨组织中 miRNA 的表达谱，结果发现有 34 个 miRNA表达差异有统计学意义，其中 11 个高表达，23 个低表达。作者同时对传统中央型骨肉瘤、毛细血管扩张型骨肉瘤、软骨母细胞型骨肉瘤以及软组织肉瘤的 miRNA 表达谱进行了比较，发现这些骨肉瘤的 miRNA 表达谱差异较小，提示 miRNA 可能代表一种共有的致瘤程序而与细胞分化状态无关[10]。Thayanithy 等[18]对代表 22 种类型肉瘤的 300 多例标本进行了分析，结果发现与其它肉瘤相比，骨肉瘤中位于基因族位点 14q32 的 miRNA 明显低表达，而 miR-17-92 族则明显高表达。作者进一步对骨肉瘤与正常骨组织的 miRNA 表达谱进行了分析，调整倍数超过2 的 miRNA 共有 36 个，基因族位点 14q32 的 miRNA 在骨肉瘤中均下调 5～6 倍，而 miR-17-92 族均明显上调。骨肉瘤细胞系与成骨细胞系的 miRNA 表达谱分析结果与上述内容基本一致。魏任雄等[16]提取 7 例骨肉瘤组织和正常骨组织的 miRNA，用 miRNA 芯片进行分析，结果发现骨肉瘤中上调的 miRNA 有 28 个，下调的有 26 个。Maire 等[17]对 7 个骨肉瘤标本与正常成骨细胞的 miRNA表达谱进行了研究，发现有 38 个 miRNA 的表达存在明显差异性，高表达的 miRNA 有 10 个，低表达的有 28 个。其中上调倍数最高的 miR-451 和 miR-497，下调倍数最高的为 miR-100 和 miR-154。作者认为这些表达失调的miRNA 主要通过转录后调控与骨肉瘤发生相关的细胞通路和基因[17]。Novello 等[19]对骨肉瘤标本和正常组织的表达谱对比发现，40 个 miRNA 的表达存在差异，其中 80%的 miRNA 在骨肉瘤标本中表达下降，其中下调程度最大的分别为 miR206，miR-1，miR-133a 以及 miR-133b。Duan 等[20]发现，与正常成骨细胞相比，骨肉瘤中存在差异性表达的 miRNA 共有 5 个，其中高表达的为 miR-151-3p 和 miR-191，低表达的为 miR-199a-3p，miR-127-3p 以及 miR-376c。Hu 等[21]对骨肉瘤细胞和成骨细胞系的 miRNA 表达谱进行了比较，发现了 268 个 miRNA在两者之间的表达存在差异，其中表达上调的有 miR-9，miR-99，miR-195，miR-148a 和 miR181a，表达下调的有miR-143，miR-145，miR-335 和 miR-539。Lulla 等[4]对骨肉瘤标本、骨肉瘤细胞系以及正常成骨细胞的 miRNA表达谱进行了比较，发现了 22 个表达差异性的 miRNA，而骨肉瘤标本、骨肉瘤细胞系、成骨细胞之间的两两比较，骨肉瘤 ( 骨肉瘤标本与骨肉瘤细胞系 ) 中均高表达的共 4 个 miRNA ( miR-135b、miR-150、miR-542-5p 以及 miR-652 )。这其中低表达的 miR-135b 已经被证实在成骨细胞的正常发育和矿化过程中起着重要的作用，高表达 miR-135b 会导致不正常的矿化以及成体干细胞异常分化[22]。这一结果也许可以解释 miRNA-135b 在骨肉瘤中高表达的原因。

骨肉瘤中起着癌基因作用的 miRNA

miRNA 主要通过抑制它的靶基因来起调控作用，至今尚未发现具有上调靶基因能力的 miRNA。如果 miRNA的靶基因是抑癌基因，那么这些 miRNA 可以促进肿瘤的发生，因此可以将它们视为癌基因。miR-21 在多种肿瘤中被证实为致癌基因。通过对 8 组骨肉瘤以及正常组织、MG-63 细胞的对比，Ziyan 等[23]发现 miR-21 在骨肉瘤组织中明显过表达，进一步研究发现 miR-21 能够通过降低RECK 基因 ( 一种肿瘤抑制基因 ) 的表达，而 RECK 基因能够抑制基质金属蛋白酶的活性，从而促进骨肉瘤细胞的细胞侵袭和迁移能力，有研究证实 RECK 基因与骨肉瘤的 5 年生存率、复发以及转移密切相关[24-25]。Montanini等[26]的研究发现，miR-93 在 MG-63 ( p53-/-) 和 Saos-2 ( p53-/-) 细胞系中表达与成骨细胞系无明显差异，而在143B 细胞系 ( p53+/+) 中则明显高表达。上调 miR-93 的表达后，143B 细胞系的增殖能力增加，而 MG-63 细胞系则无明显变化。作者推测在 p53 阳性表达的细胞中，miR-93可能通过调节 E2F1，从而抑制 p21 转录后表达，促进肿瘤的发生和转移[26]。

骨肉瘤中起着抑癌基因作用的 miRNA

Jones 等[10]通过实验证明了 miR-16a 在骨肉瘤的发生中起着抑癌基因的作用，骨肉瘤细胞系与正常成骨细胞系相比，miR-16a 的表达明显下降。裸鼠成瘤实验证实过表达 miR-16a 的骨肉瘤细胞所形成的肿瘤体积和重量都要明显小于对照组，同时 caspase-3 的活性要高于对照组。He 等[27]的研究发现 miR-34 在骨肉瘤中表达明显降低，miR-34 作为 p53 的下游分子，能够上调 CDK6、E2F3、CyclinE2 以及 Bcl-2 的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡。Wu 等[28]的研究证实 miR-34a 能够通过下调 Eag1蛋白从而抑制骨肉瘤的增殖。Yan 等[29]通过体内外实验证实，过表达 miR-34a 能够抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移能力，同样也能抑制小鼠模型中骨肉瘤的生长和肺部转移的发生率。作者发现 c-Met 是 miR-34a 的靶基因之一，miR-34a 可能还通过其它的途径参与调节骨肉瘤的发生及发展过程。Zhang 等[30]的研究发现 miR-143 在骨肉瘤组织和细胞系中低表达，Bcl-2 为 miR-143 的靶基因之一。提高 miR-143 的表达能够降低肿瘤细胞活性，促进细胞凋亡。Braun 等[31]发现在表达野生型 p53 的骨肉瘤细胞U2OS 中，p53 能够诱导 miR-192、miR-194 以及 miR-215的表达，同时 miR-192 以及 miR-215 能够诱导 p21 蛋白( p53 基因的产物 ) 的表达，转染 miR-192 后能使 U2OS 细胞的增殖潜能下降。miR-31 也与 p53 通路密切相关，过表达 miR-31 能够明显抑制 U2OS 的增殖[32]。有研究发现miR-125b 能够下调 STAT3，而与 miR-199a-3p 能够下调mTOR 和 STAT3 的表达，从而抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移能力[20,33]。Jin 等[34]的研究证实 miR-376c 能够下调TGFA 蛋白的表达从而抑制骨肉瘤的增殖和侵袭能力。

与骨肉瘤转移相关的 miRNA

肺部是骨肉瘤转移最常见器官，肺部转移也是骨肉瘤患者的主要死因。约 80% 的骨肉瘤患者，在诊断为骨肉瘤时已经发生了无症状的肺部的微小转移灶[35]。骨肉瘤一旦发生肺部转移，意味着患者的预后不良，即使采取多种治疗手段，其 5 年生存率大约在 25%～30%[36-38]。骨肉瘤肺外转移也是治疗的难题之一[35]。

Jones 等[10]对发生转移的骨肉瘤和未转移的骨肉瘤标本的 miRNA 谱进行了比较，发现有转移的骨肉瘤标本中，miR-181c 和 miR-27a 的表达明显增加，上调倍数分别为 1.75 和 4.53。作者同时通过骨肉瘤细胞系和动物实验验证了 mir-27a 能够明显增加骨肉瘤的转移能力。Osaki等[39]使用小鼠肺转移模型中，比较了 HOS 以及 143B 骨肉瘤细胞的 miRNA 表达谱 ( 143B 是 HOS 的亚克隆，具有高转移能力 )。结果发现 143B 中的 miR-143 的表达明显降低，转染 miR-143 的 143B 细胞的侵袭性明显下降，但是增殖能力无明显变化。同时静脉注射 miR-143 后，能够明显抑制 143B 细胞在小鼠中肺转移的发生率。免疫沉淀反应发现 MMP-13 是 miR-143 的靶蛋白，作者认为miR-143 的低表达导致 MMP-13 的上调，从而促进骨肉瘤的转移能力[39]。Huang 等[40]的研究发现，过表达 miR-20a会降低骨肉瘤细胞系 SAOS-2 细胞系中 Fas 蛋白的表达，从而增加骨肉瘤细胞的转移能力。Yan 等[29]发现 miR-34a能够下调 c-Met ( 与肿瘤转移密切相关的蛋白 ) 的表达。动物实验发现，表达 miR-34a 的小鼠骨肉瘤肺部转移的瘤灶的数目、体积都要明显低于对照组，提示 miR-34a能够抑制骨肉瘤的转移[29]。Mao 等[41]发现 miR-195 能够通过作用于靶基因 FASN 从而抑制骨肉瘤的迁移和侵袭能力。

与骨肉瘤化疗敏感性相关的 miRNA

目前手术切除是骨肉瘤患者主要的治疗手段，但是辅助化疗以及新辅助化疗能够明显改善骨肉瘤患者的预后。术前新辅助化疗使得骨肉瘤患者的无病生存率由原来的＜20% 提高到 55%～75%，同时使得 80% 的骨肉瘤患者可以避免截肢手术[35]。多中心的随机对照试验证实，使用辅助化疗的骨肉瘤患者与不接受化疗的对照组相比，6 年的无病生存率明显高于对照组 ( 61% 比 11%，P＜0.001 )[42]。化疗敏感性与骨肉瘤患者的预后密切相关，但是目前 40% 的骨肉瘤患者仍然对化疗不敏感[43]。研究者通过改良辅助化疗药物等方式来提高化疗敏感性，但是效果并不理想。目前仍没有发现与骨肉瘤化疗敏感性确切相关的标记物。多项研究对 miRNA 与化疗敏感性之间的关系进行了报道[44-45]。

Jones 等[10]将对化疗敏感与不敏感的骨肉瘤的 miRNA表达谱进行了研究，同时通过 RT-PCT 验证发现 miR-451与 miR-15b 是在化疗不敏感的骨肉瘤中表达倍数明显下调，下调倍数为分别 5.26 和 2.38。Song 等[44]通过体外实验证实 miR-215 能够通过作用于细胞周期调控相关的核蛋白，使骨肉瘤细胞停滞于 G2 期，从而导致骨肉瘤对甲氨蝶呤和雷替曲塞产生化疗抵抗。Song 等[45]的研究发现 miR-140 能够通过抑制组蛋白去乙酰酶 4 ( HDAC4 ) 的表达，从而导致骨肉瘤细胞对甲氨蝶呤和 5-氟尿嘧啶的不敏感性。该研究还发现过表达 miR-140 能够诱导 U2OS和 MG-63 细胞发生 G1 及 G2 期阻滞，抑制骨肉瘤细胞增殖。Gougelet 等[46]为了研究与骨肉瘤化疗敏感性相关的miRNA，使用异环磷酰胺对骨肉瘤标本、骨肉瘤细胞系以及骨肉瘤模型小鼠的样本进行化疗，检测其 miRNA 表达谱。作者采用监督层次聚类算法对结果进行分析后发现，共有 5 个 miRNA 与骨肉瘤的化疗敏感性密切相关，化疗敏感性好的骨肉瘤中 miR-92a、miR-99b、miR-193a-5p、miR-422a 过表达，而 miR-132 低表达。作者进一步通过生物信息学发现，这 5 个 miRNA 通常都通过 MAP 激酶、TGFβ 以及 Wnt 通路参与细胞周期调控、细胞侵袭以及骨吸收等过程。Wang 等[47]发现，过表达 miR-138 能够下调磷酸化的组蛋白 ( γH2AX ) 的表达，导致细胞在 DNA 损伤以后产生染色体不稳定，从而提高骨肉瘤细胞对化疗的敏感性。

目前为止，尚不清楚哪一种异常机制是骨肉瘤发病的主要原因。骨肉瘤的发病机理非常复杂，与多种基因和细胞遗传学的异常有关，包括癌基因和抑癌基因的突变，染色体增加、缺失、异位等，主要信号转导通路的失调，端粒酶的活性异常等等，主要与染色体 1、9、10、13、17，以及 p53 和 Rb 基因的异常有关[48]。大多数学者认为骨肉瘤是由于间质干细胞在向成骨分化过程中受阻所致[48-50]。miRNA 参与多种重要生命过程中的调控，同时也证实在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用[5,15]。有关骨肉瘤中差异性表达的 miRNA 的研究发现，骨肉瘤中存在特异性表达的 miRNA 谱，这一特点可以使得 miRNA 表达谱作为诊断骨肉瘤新的手段。不同的研究结果差异性表达的 miRNA 种类存在不一致的情况，但是这些特异性表达的 miRNA 在骨肉瘤的发生发展过程中起着重要的作用[4,10,16,18]。虽然骨肉瘤中 miRNA 的高通量筛查结果不能直接解释骨肉瘤的发生机理，但是能为将来研究骨肉瘤的发病机制提供很好的平台。

此外，骨肉瘤中差异性表达的 miRNA 也可以作为新的治疗靶点。基于 miRNA 的治疗手段为肿瘤的治疗提供了新的出路，这些治疗手段主要包括以下几方面：( 1 )使用反义寡核苷酸抑制癌基因 miRNA 的表达；( 2 ) 使用miRNA 模拟物 ( miRNA mimics ) 促进抑癌基因 miRNA 的表达；( 3 ) 使用锁定核酸技术 ( Locked nucleis acids ) 来提高 miRNA 与靶基因的亲和力；( 4 ) miRNA 海绵，这种表达载体的功能等同于 miRNA 抑制剂，能够有效降低细胞中 miRNA 的含量。miRNA 治疗技术在真正应用于临床之前，仍有一些问题需要解决，如何使作用于 miRNA 的新型治疗药物能够具备较好的器官特异性，如何提高它们的生物利用度，如何减少副作用，以及给药途径的选择等[51]。

尽管近年来，有关骨肉瘤与 miRNA 的研究层出不穷，并且也取得了一定的成果。但是我们必须意识到miRNA 与骨肉瘤的研究才刚刚开始，我们仍面临着许多难题。尽管我们发现了多个 miRNA 与骨肉瘤相关，但是有直接证据证明 miRNA 的靶基因及其功能的 miRNA 并不多，很多的 miRNA 的功能及作用途径仍不明确。此外miRNA 与靶基因之间的调控网络，miRNA 之间的相互调控，miRNA 与间质干细胞分化的关系，miRNA 与骨肉瘤转移、复发及化疗敏感性的关系也是需要进一步研究的内容。

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( 本文编辑：王永刚 )

Research progress on the role of micro-ribonucleic acid in osteosarcoma

ZHAO Xiao-lei, CAI Lin, DENG Zhou-ming. Department of Orthopedics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan, Hubei, 430071, PRC

Primary malignant tumors of bone are extremely rare, accounting for about 0.2% of all cancers.Osteosarcoma is the most common form of primary malignant tumors of bone and accounts for approximately 19% of all malignant tumors of bone. It is the 3rd most common malignant tumor in teenagers, after leukemia and cerebral cancer. Current treatment methods of osteosarcoma mainly include surgical resection, chemotherapy and radiotherapy. The disease-free survival rate has been escalated from ＜20% prior to the introduction of neoadjuvant chemotherapy to around 60%, and the overall survival rate reaches to 60%-70%. However, tumor metastases frequently occur, which will result in poor prognosis. The pathogenesis of osteosarcoma has not been clearly understood until now. It is important to further study the occurrence and metastasis mechanisms of osteosarcoma and continue searching for therapeutic targets for the improvement of treatment effects. During the last decade, there is a major discovery of small ribonucleic acid ( RNA ) in bioscience, including microRNA ( miRNA ). MiRNA is noncoding small RNA of 18-25 nucleotides that represses translation and cleaves messenger RNA ( mRNA ) by base-pairing to the 3’ untranslated region ( UTR ) of the target genes, so as to regulate the growth, development and differentiation of the organism. Accordingly, miRNA infuences numerous cancer-relevant processes such as proliferation, cell cycle control, apoptosis, differentiation, migration, invasion and metabolism. The expressions of most mRNAs may be regulated by miRNAs, and the cancer-related signaling pathways may be profoundly infuenced. MiRNAs can function as tumor suppressors and oncogenes. In recent years, the role of miRNA in the pathogenesis and development of osteosarcoma has been gradually revealed by the scholars. A novel approach for investigating the pathogenesis of osteosarcoma has been provided, and meanwhile new hope has been brought for the treatment of osteosarcoma.

Osteosarcoma; Gene expression regulation, neoplastic; Oncogenes; MicroRNA

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.10.012

R738.1

武汉大学研究生资助科研项目 ( 2012303020207 )；中央高校基本科研业务费专项基金资助

430071 湖北，武汉大学中南医院骨科

蔡林，Email: guke3559@aliyun.com

2013-06-06 )