环孢素A 滴眼液治疗干眼症的作用机制和研究进展

曾 洁，周渝姣，张传宝

(1. 卫生部北京医院·卫生部临床检验中心生化室，北京 100730; 2. 中国人民解放军第77100 部队门诊部，重庆 400014)

干眼症(DES)又称角结膜干燥症(KCS)，是由于液性泪液产生减少、黏液分泌异常和睑板腺功能障碍等各种原因引起的泪液膜液性成分的绝对和相对缺乏，以眼表泪液分布异常、泪液蒸发增加为共同特征的综合征。干眼症与多种因素有关，发病率为7.4% ～33.7%，其中50 岁以上女性患病率约为男性的2 倍[1-2]。在某些疾病中，其发病率更高，如在糖尿病患者和风湿性关节炎患者中分别为54.3%和46.7%[3-4]。我国40 岁以上藏族人和高中生出现干眼症状的概率分别为52.4%和23.7%[5-6]。干眼症的传统治疗方法为使用人造眼泪和SmartPlug 泪道栓塞植入。对于斯耶格伦氏综合征(Sjogren's syndrome)这类与炎症相关的干眼症，应使用类固醇或非固醇类消炎药，如皮质类固醇、四环素、环孢素(cyclosporine)等[7]。1995 年，美国食品药物管理局(FDA)批准了0.2%环孢素A 眼用油膏(Optimmune)用于治疗犬类角结膜干燥症，2003 年批准了0.05%环孢素A 眼用乳液(RestasisTM)用于人眼干燥症，目前尚未在我国上市销售。环孢素A(CsA)滴眼液疗效好，且无全身性不良反应，近10 年来在欧美国家临床得到了广泛应用。现就CsA 滴眼液的发展历程、作用机制及治疗干眼症的研究进展等进行简要介绍。

1 发展历程

CsA 由11 个氨基酸组成，分子式为C62H111N11O12，相对分子质量为1 202。1970 年，Sandoz 公司首次从光泽柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)和多孔木霉( Tolypocladium inflatum)这2 种真菌中发现了一类新的天然的亲脂环肽，称为环孢素。由多孔木霉分泌的环孢素除了CsA 外，还会产生其他多种环孢素，都有11 个氨基酸，区别在于有1 个或1 个以上的氨基酸不同，如环孢素B 与CsA 的差异就在于2 位上的氨基酸分别是丙氨酸和α-氨基丁酸。环孢素最初的研究目的是用于抗真菌治疗，但其抗菌谱窄，没有实际应用价值。随后发现，环孢素具有抗淋巴细胞活性的免疫抑制作用，并确认CsA 的免疫抑制作用最强。CsA 能选择性地作用于脾淋巴细胞，而不影响骨髓细胞数量和干细胞增殖，比硫唑嘌呤(azothioprine)类药物的毒性小很多，常用于器官移植后排斥反应的治疗。山地明(Sandimmune)是美国FDA 批准的第1 个CsA 药物。CsA 作为一种强效免疫抑制剂，不仅用于器官移植后的免疫抑制治疗，还可用于治疗多种临床疾病包括自身免疫病、血液病、肿瘤，以及抗寄生虫病、抗HCV 治疗、抗HIV 治疗、治疗眼部感染等。

CsA 滴眼液用于治疗干眼症始于对犬类的研究，使用CsA 后能增加犬的眼泪量(≥5 mm/min)。早期临床发现，在对接受肾移植患者进行免疫治疗时，口服CsA 会增加患者的眼泪量。各类临床试验也证明，使用CsA 滴眼液能增加患者眼泪量。CsA 是难溶于水的疏水性物质，选择适宜的基质使其能长时间停留在眼外部组织且无不良反应，是CsA 滴眼液研发的难点。直接使用蓖麻油、玉米油、橄榄油、花生油等油性基质，会有灼烧、红肿、痒及导致上皮角膜炎等不良反应。有学者研发了一种水包油型微乳，含有甘油、聚山梨醇酯80 和氢氧化钠等辅料，能加载0.4% 的CsA，室温稳定性超过9 个月。动物试验结果表明，上述空白基质未表现出明显的不良反应，且外用CsA 眼用乳液的安全性高:连续使用0.4%浓度的药品3 个月，每天用药3 次，兔CsA 血药浓度最大为0.721 ng/mL;连续使用6 个月，每天用药4 次或6 次，兔血药浓度最大为1.36 ng/mL;连续用药12 个月，每天6 次，狗最大血药浓度为0.654 ng/mL。人使用0.05%和0.1%浓度的CsA 眼用乳剂12 个月后，用液相色谱串联质谱法测定，血药浓度低于该方法检测限(0.3 ng/mL)，且在0.1%浓度组用药3 h 后的最大浓度为0.105 ng/mL[8]。针对该CsA 眼用乳液的Ⅱ期和Ⅲ期临床试验表明，该药在0.05%，0.1%，0.4%浓度水平下均能显著改善中、重度干眼症患者的眼部症状和体征，且无明显的局部或全身性不良反应[9-10]。在一项持续3 年的长期临床研究中，使用0.1%CsA 眼用乳液每次1 滴，每日2 次，未表现出全身性不良反应，局部不良反应表现为眼部出现灼烧感、刺激感和结膜充血，发生率分别为10.9%，3.9%，3.4%[11]。除RestasisTM这个已上市的产品外，增加CsA 的溶解度，提高生物利用度，降低(或减少)局部不良反应的方法有很多，包括设计水溶性前药及使用脂质体、纳米粒等新型药物制剂等手段。带正电荷的乳剂能与带负电荷的角膜上皮细胞相互作用，并在角膜表面长时间停留，对角膜有更好的湿润作用，相关的Ⅰ期临床研究正在进行中[12]。

2 治疗干眼症的作用机制

2.1 免疫抑制

CsA 有免疫抑制作用，能抑制T 淋巴细胞的活化、分化，主要作用于钙调磷酸酶(CaN)/NF-AT 途径，其机制为:CsA 选择性地与T 细胞内的亲环素A(CyPA)相结合，所形成的CsA-CyP 复合物作用于CaN，使CaN 去磷酸化活性失活，抑制胞浆NF-AT核内转移，从而抑制包括白细胞介素2(IL-2)在内的多种细胞因子基因的转录激活，抑制T 细胞的分化、活化。干眼症患者接受0.05%CsA 滴眼液治疗6 个月后，结膜上皮细胞CD3+，CD4+，CD8+细胞及CD11a和HLA-DR 细胞数量显著降低(P ＜0.05)[13]。Baudouin 等[14]的研究也证明，HLA-DR+结膜细胞数量在治疗3，6，12 个月后显著下降，从初始的(61.67 ±29.54)%分别降到了(39.03 ±29.54)%，(39.45±33.06)%，(30.55±29.40)%。使用CsA 后白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素17A、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)和嗜酸性粒细胞趋化因子等细胞因子在眼泪中的浓度都显著降低(P ＜0.05)[15]。还有报道称，CsA 还能通过作用于JNK 和p38 信号通路发挥免疫抑制作用，并希望通过对该抑制作用的探究，寻找新的免疫抑制位点[16-18]。

2.2 抗细胞凋亡

CsA 有抑制细胞凋亡作用。CsA 与亲环素D 结合形成复合物，能抑制线粒体膜通透性转换孔开放(mPTP)，防止膜间蛋白如细胞色素C、核酸内切酶等释放入胞浆，从而抑制细胞凋亡或坏死。Gao 等[19]在早期的动物研究中发现，CsA 治疗Sj gren 型KCS时，能抑制泪腺腺泡细胞和结膜上皮细胞凋亡，并促进淋巴细胞凋亡;CsA 治疗后，p53 蛋白免疫活性降低而bcl-2 水平升高。CsA 滴眼液的抗凋亡作用主要针对结膜上皮细胞，病理小鼠经CsA 处理后，球结膜和睑结膜上皮细胞凋亡数量远远低于未经干预的对照组(P ＜0.01)，且活化的凋亡蛋白酶caspase-3 水平也低于对照组(P ＜0.01);这种抗凋亡作用在角膜上皮细胞中并不明显[20]。

2.3 促杯状细胞水平上升或功能恢复

杯状细胞的功能是合成、贮存和分泌黏蛋白，结膜杯状细胞位于结膜上皮层，主要分泌分子量大的凝胶形成型黏蛋白MUC5AU[21]。黏蛋白是高度糖基化的亲水性大分子蛋白质，是泪膜的重要成分，起稳定泪膜保护眼表的作用。黏蛋白分泌量的减少和糖基化的改变，是干眼症发病机制中的中间环节，也是干眼症的结果之一[22]。Moore 等[23]通过切除泪腺建立了犬角结膜干燥症模型，2% CsA 连续用药4 周，上皮细胞内黏蛋白浓度显著增加(P ＜0.05)，结膜炎症状得到缓解，说明在不受泪腺作用的影响下，CsA 对恢复结膜杯状细胞黏蛋白分泌功能有作用，这可能是CsA 治疗干眼症的重要因素。Wang 等[24]对患有慢性移植物抗宿主病患者的干眼症治疗结果也证明了这一观点，0.05% CsA 治疗后杯状细胞密度和MUC5AU 数量显著升高(P ＜0.05)，MUC5AU mRNA 表达也显著增加(P ＜0.05)。

2.4 增加眼泪流量

CsA 治疗后，眼泪分泌试验(Schirmer's Test)结果显著改善。CsA 增加眼泪流量的机制:CsA 刺激泪腺感觉神经末梢释放神经递质P 物质，并通过P 物质激活毒蕈碱受体，增加眼泪分泌[25];增加水通道蛋白3 的表达量及其转运水的能力，以增加眼泪量，后者与细胞内环磷酸腺苷(cAMP)浓度有关[26]。CsA 能增加细胞内环磷酸腺苷水平，活化蛋白激酶A，后者催化水通道蛋白的丝氨酸磷酸化，从而增加膜对水的通透性。这些研究表明，CsA 增加眼泪流量不是单纯地刺激眼表的催泪作用。

3 治疗干眼症的临床研究

3.1 干眼症症状缓解程度的评价

CsA 滴眼液在干眼症方面的相关临床研究，除了上文提到的安全性、有效性等常规临床评价，对干眼症症状缓解程度的评价也是临床关注的重要方面。Stonecipher 等[27]研究发现，32%的KCS患者使用0.05%CsA 滴眼液7 d 后症状得到缓解，60%患者治疗30 d 后减少了人造眼泪的使用[27]。CsA 较人造眼泪的疗效要好，分别有94%和68%的患者在治疗12 个月后症状得到缓解[28]。而且，对于某些人造眼泪治疗3 个月无效的干眼症患者，改用CsA后角膜和结膜知觉敏感度都有提高[29]。比较CsA 滴眼液和泪管封闭治疗，前者能提升眼表的长期健康，后者起效快，二者联合治疗效果最佳[30]。对于肝移植且患有家族性淀粉样多发性神经病变的患者，干眼症症状经人造眼泪和泪腺封闭治疗无效，采用CsA滴眼液治疗能显著改善干眼症症状且无任何不良反应[31]。然而，Yüksel 等[32]通过印迹细胞学技术发现，CsA 滴眼液对重度干眼症疗效不佳。

3.2 移植物抗宿主病(GVHD)患者干眼症的疗效

CsA 滴眼液治疗1 个月，杯状细胞密度和MUC5AC mRNA 表达增加(P ＜0.05);对于人造眼泪治疗3 个月无效的患者，改用CsA 治疗3 个月后，泪膜破裂时间等指标明显改善(P=0.002)[33];治疗过程中未发现明显的不良反应[34]。

3.3 格雷夫斯病患者干眼症的疗效

Gürdal 等[35]评价了CsA 滴眼液使用前后的眼表疾病指数、结膜细胞凋亡指数、结膜MMP-9 表达水平等干眼症相关指标，认为CsA 能改善格雷夫斯病患者的干眼症状，抑制结膜上皮细胞凋亡和抑制MMP-9 表达[35]。但Altiparmak 等[36]的临床试验却认为，单独使用人造眼泪的疗效优于CsA 和人造眼泪联合用药，前者Schirmer 试验和泪膜破裂时间结果都优于后者(P=0.004，P=0.021)。

3.4 0.05%CsA 滴眼液使用的临床建议

对于重度干眼症患者，应增加每日用药次数，如每日4 次[37]。虽然有4%慢性干眼症患者经CsA 滴眼液治疗，停药1 年以上未出现复发[38]，但大多数患者停药后干眼症病程会向前发展[39]，对于已停药的患者，可用CsA 滴眼液进行第2 次治疗。医生应叮嘱患者长期坚持使用，一般来说，治疗干眼症需要连续用药6 个月以上，应告知患者出现刺激感等反应是正常的，这种感觉会随着使用时间增加而减少[40]。CsA 滴眼液除了用于干眼病，还可用于多种眼表疾病的治疗，如后部睑缘炎、眼红斑痤疮、春季角结膜炎、特应性角结膜炎、急性角膜移植排斥、结膜移植物抗宿主病等[41]。

4 结语

干眼症的发病因素多且在女性中发病率高，CsA 滴眼液通过免疫抑制、抗细胞凋亡、增加杯状细胞密度和黏蛋白分泌水平以及增加眼泪流量等方式，能有效治疗各种类型的干眼症。临床前动物试验、Ⅱ期临床试验、Ⅲ期临床试验均证明了CsA 滴眼液的安全性和有效性。相对于类固醇类药物来说，CsA 虽然起效较慢，但却无全身性不良反应且局部不良反应小，安全性高，可长期使用。国家食品药品监督管理总局只批准了一种环孢素类外用制剂，即华北制药的环孢素滴眼液，适用于与糖皮质激素联合应用预防角膜移植术后免疫排斥反应。国内尚无直接用于治疗干眼症等眼表疾病的环孢素类外用药物，迫切需要研发能满足CsA 溶解性好、生物利用度高、眼表停留时间长、不良反应小、稳定性好等条件的有关制剂，并作进一步的临床研究，填补国内该类药物的空白，为眼科临床医生和眼病患者提供帮助。

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