微波辅助从羊肺中提取肝素钠的工艺研究

师希雄，冯瑞章，王晓娟，余群力*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川宜宾644000）

微波辅助从羊肺中提取肝素钠的工艺研究

师希雄1，冯瑞章2，王晓娟1，余群力1*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川宜宾644000）

以羊肺为原料，采用微波辅助法及盐解、沉淀剂除蛋白质的方法提取和分离肝素钠。在单因素试验基础上，设计L9(34)正交试验确定最佳提取工艺条件。结果表明，最佳提取工艺为料液比1∶15（g∶mL），微波作用时间180 s，微波功率480 W，沉淀剂用量为0.8%，此条件下肝素钠得率为294.78 mg/kg。

羊肺；肝素钠；提取；微波；工艺优化

肝素是由葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、氨基葡萄糖与硫酸聚合而成的黏多糖，其结构为四糖单元所组成的聚合物，肝素钠是分子质量不同的酸性黏多糖相混合的硫酸氨基多糖的钠盐[1]。肝素钠是一种很好的抗凝血药物，主治血栓、心脏病和肾病等，现在认为肝素钠通过激活抗凝血酶而发挥抗凝血作用，近几年发现在临床上的新用途有：治疗肺间质纤维化、骨关节炎、小儿急性偏瘫、慢性肾小球肾炎，抗炎、抗过敏、抗病毒、抑制癌细胞增殖以及增进人体免疫功能等生物活性[2-5]。

我国畜禽副产物极其丰富，据统计，每年羊的脏器产量就达到200多万t，其中，肺脏与肠粘膜中肝素钠含量丰富，这为肝素钠的生产提供了丰富的原料，但是，目前羊脏器制药的利用率还很低，一部分以食料的形式出售和加工，一部分未被利用，这样不仅附加值非常低，而且浪费资源，污染环境，因此，有必要利用羊的脏器开发具有抗凝血、抗血栓等功能的肝素钠。

肝素钠提取方法有盐析法、超声波辅助法、酶解法或者结合使用[6-9]。近年来，微波辅助技术在有效成分的提取方面得到广泛应用，该技术具有加热效率高、选择性高、穿透力强、提取时间较短的特点，利用微波对细胞的破壁和加热作用，可加速有效成分的快速溶出[10-12]。以羊肺为原料，采用微波辅助的方法制备肝素钠的研究鲜有报道，本试验以羊肺为材料，采用微波辅助的方法提取肝素钠，以便为肝素钠的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肝素钠标准品：贵州迪大生物有限公司；氯化钠、乙醇（95%vol）、明矾、氢氧化钠、硫酸、硼砂、D254离子交换树脂吸附剂均为分析纯：杭州恒鑫达化工有限公司。

羊肺来自兰州大尾羊。

1.2 仪器与设备

JJ-2B组织捣碎匀浆机：金坛市医疗仪器厂；85-2恒温磁力搅拌器：常州国华电器有限公司；PH-3C型酸度计：上海佑科仪器仪表有限公司；HH-S8型电热恒温热水槽：北京科伟永兴仪器有限公司；BPZ-6930LC真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；SHB-IIIG真空抽滤机：郑州长城科工贸有限公司；756P紫外-可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；HX-Z电子天平：慈溪市天东衡器厂；洗脱柱Φ30 mm×300 mm：大连日普利科技仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肝素钠的提取工艺流程[13]

1.3.2 操作要点

（1）预处理：称取解冻后的羊肺100 g，按照一定的料液比加入一定量的水，在组织捣碎机中捣碎至肉糜状，然后用2 mol/L NaOH将pH值调至8.7[9]。另外，将树脂用2 mol/L NaOH浸泡6～7 h将其活化，保存备用。

（2）微波处理羊肺：将肉糜按设计的微波功率与作用时间进行处理。

（3）提取：在微波处理后的肉糜中，加入样品量5%的NaCl，60℃下每隔10 min搅拌30 s，连续进行该操作2 h，之后立刻升温至95℃，静置10 min沉淀蛋白，用100目筛过滤，收集滤液。

（4）吸附：待滤液冷却到50℃，用2 mol/L NaOH将pH值调至8.5，然后加入8%的树脂（蒸馏水冲至中性），50℃下于恒温磁力搅拌器中连续吸附8 h，然后用100目筛过滤，收集树脂备用。

（5）洗涤与洗脱：将树脂装入洗脱柱，用蒸馏水反复冲洗3～5次直至无色，用1.2 mol/L的NaCl浸泡洗涤树脂30 min，弃滤液。先将5 mol/L的NaCl加入树脂洗脱柱中浸泡3 h，用三角瓶收集浸提液；再用3.5 mol/L的NaCl浸泡2 h，用同一个三角瓶收集液体，重复此操作2次，滤液三角瓶中备用。

（6）沉淀：在滤液中加入0.8%（质量比）的明矾，在50℃下处理1 h，用滤纸过滤，收集滤液。在滤液中加入1.5倍体积分数为95%乙醇，充分摇匀后静置12 h，真空抽滤，保留固体。

（7）粗品干燥：将抽滤得到的固体物料在真空干燥箱中60℃干燥至质量恒定，得到肝素钠粗品。

1.3.3 标准曲线的绘制

准确称取肝素钠标准品，配成482 μg/mL肝素钠水溶液，再按0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL的质量浓度梯度，分别吸取不同体积的肝素钠水溶液，用蒸馏水定容到1 mL，向每份溶液中分别加入3 mL含0.025 mol/L硼砂的体积分数为90%硫酸溶液，然后充分摇匀，放在90℃水浴中，连续搅动10 min后取出，冷却至室温，30 min后采用紫外-可见分光光度计测定波长298 nm时的吸光度值（另做不加肝素钠，用水代替的空白试验作为对照），重复3次，取平均值，绘制标准曲线[7]。

1.3.4 肝素钠含量的测定

肝素钠粗品用四分法取出后，用蒸馏水定容到25 mL的容量瓶中配制成待测液，吸取1 mL待测液加入玻璃管中，再加入3 mL含0.025 mol/L硼砂的90%硫酸溶液，摇匀，在90℃的水浴中加热10 min，同时，不断搅动，然后冷却至室温，30 min后采用紫外-可见分光光度计测定波长298 nm时的吸光度值（另做不加肝素钠，用水代替的空白试验作为对照），重复三次，取平均值。在标准曲线上可得到提取物中肝素钠的含量[7]。肝素钠得率计算公式如下：

式中：A为样品所测得的吸光度值；M总为所得肝素钠粗品的总质量，g；m溶为溶解在25 mL容量瓶中肝素钠的质量，g；m样为所取羊肺样品的质量，g；25为定溶于25 mL容量瓶中；n为稀释倍数。

1.3.5 单因素试验

（1）微波作用时间

在料液比1∶15（g∶mL），微波功率480 W，沉淀剂用量0.8%的条件下，考察微波作用时间（90 s、120 s、150 s、180 s、210 s）对肝素钠得率的影响，重复3次。

（2）微波功率

在料液比1∶15（g∶mL），微波作用时间180 s，沉淀剂用量0.8%的条件下，考察微波功率（273 W、373 W、480 W、587 W、693 W）对肝素钠得率的影响，重复3次。

（3）料液比

在微波功率480 W，微波作用时间180 s，沉淀剂用量0.8%的条件下，考察料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））对肝素钠得率的影响，重复3次。

（4）沉淀剂用量

在微波功率480 W，微波作用时间180 s，料液比1∶15的条件下，考察沉淀剂用量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）对肝素钠得率的影响，重复3次。

1.3.6 正交试验

在单因素试验的基础上，设计L9（34）正交试验，确定肝素钠提取的最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

用肝素钠标准品进行吸光度值测定，依据测定结果得到肝素钠标准曲线如图1所示。

图1 肝素钠标准曲线Fig.1 Standard curve of heparin sodium

以肝素钠质量浓度（X）为横坐标，肝素钠在波长298 nm处的吸光度值（Y）为纵坐标，根据测定结果绘制标准工作曲线，线性回归方程为：Y=0.003 9X+0.052，相关系数R2=0.999 4，表明二者线性关系良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 微波作用时间对肝素钠得率的影响

图2 微波作用时间对肝素钠得率的影响Fig.2 Effect of microwave time on heparin sodium yield

图2反映了微波作用时间对肝素钠得率的影响，由图2可知，随着微波作用时间的增加，肝素钠的得率不断升高，当微波作用时间达到180 s时，得率达到最高值，继续增加微波作用时间时，肝素钠得率开始降低。这可能由于多糖类物质在高温下容易分解，在提取初期，肝素钠能够被不断浸出，但是，随着作用时间的延长，温度逐渐升高，部分肝素钠被热解，从而使得率下降[14]。因此，微波作用时间180 s较好。

2.2.2 微波功率对肝素钠得率的影响

图3 微波功率对肝素钠得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on heparin sodium yield

图3反映了微波功率对肝素钠得率的影响，由图3可知，当微波功率在273～480 W范围内时，随着微波功率的增加，肝素钠的得率呈显著上升的趋势，功率达到480 W时，得率达到最高值。然而，当微波功率进一步增加时，肝素钠得率不断下降。这可能是因为微波功率过大造成温度过高使多糖部分分解，从而使得率下降[15]。因此，选择微波功率480 W较好。

2.2.3 料液比对肝素钠得率的影响

图4 料液比对肝素钠得率的影响Fig.4 Effect of l material liquid ratio on heparin sodium yield

图4反映了料液比对肝素钠得率的影响，由图4可知，当液料比在1∶5～1∶15（g∶mL）范围内时，随着料液比的增加，肝素钠得率明显提高，当料液比在1∶15～1∶25（g∶mL）范围内时，肝素钠得率呈现不断下降的趋势。故选择料液比为1∶15（g∶mL）最佳。

2.2.4 沉淀剂用量对肝素钠得率的影响

图5 沉淀剂用量对肝素钠得率的影响Fig.5 Effect of precipitation agent addition on heparin sodium yield

图5反映了沉淀剂用量对肝素钠得率的影响，由图5可知，当沉淀剂用量在0.4%～0.8%范围内时，随沉淀剂用量的增大，肝素钠得率呈现不断增加的趋势，然而，在沉淀剂的用量＞0.8%后，肝素钠得率开始下降。因此，从降低生产成本的角度考虑，沉淀剂用量选择0.8%较好。

2.3 正交试验结果

综合单因素试验结果，设计L9（34）正交试验，因素水平见表1，结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 肝素钠提取条件工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test for heparin sodium extraction conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

由表2可知，4种因素对肝素钠得率影响的主次顺序为：C＞B＞D＞A，即对肝素钠得率影响最大的因素是料液比，然后依次是微波作用时间，沉淀剂用量，微波功率。最佳的提取条件为A2B2C2D2。即微波功率为480 W，微波作用时间为180 s，料液比为1∶15，沉淀剂用量为0.8%。在最优提取条件下进行验证试验，得到肝素钠的得率为294.78 mg/kg。

由表3可知，微波功率、微波作用时间、料液比、沉淀剂用量对肝素钠得率均有极显著地影响（P<0.01）。

3 结论

微波辅助从羊肺中提取肝素钠的最佳工艺条件为：料液比1∶15（g∶mL），微波作用时间180 s，微波功率480 W，沉淀剂用量0.8%。在此条件下，羊肺中肝素钠得率为294.78 mg/kg。各因素对肝素钠得率均有极显著地影响，影响的大小次序为料液比＞微波作用时间＞沉淀剂用量＞微波功率。采用该工艺提取肝素钠操作简单，为羊肺的开发利用提供了理论依据。

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Microwave-assisted extraction technology of heparin sodium from sheep lung

SHI Xixiong1,FENG Ruizhang2,WANG Xiaojuan1,YU Qunli1*
(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Key Laboratory of Fermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province,Yibin University,Yibin 644000,China)

Using sheep lung as raw material,heparin sodium was separated and extracted by microwave-assisted method,salt-solution and precipitant deproteinization method.L9(34)orthogonal test was designed to determine the optimum process conditions on the basis of single factor test.The results indicated that the optimum extraction process was material liquid ratio 1∶15(g∶ml),microwave time 180 s,microwave power 480 W,precipitation agent addition 0.8%.Under these conditions,the heparin sodium yield was 294.78 mg/kg.

sheep lung;heparin sodium;extraction;microwave;technology optimization

S872

A

0254-5071（2014）10-0028-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.007

2014-07-08

国家现代农业产业技术体系资助（CARS-38）

师希雄（1977-），男，讲师，博士，研究方向为畜产品加工。

*通讯作者：余群力（1962-），男，教授，博士，研究方向为畜产品加工。