HPLC法测定盐酸苯海拉明乳膏的含量

白 林，范金钊，蔡 乐，徐风华（.解放军总医院药品保障中心，北京 00853；.安徽蚌埠医学院，安徽 蚌埠 33000）

HPLC法测定盐酸苯海拉明乳膏的含量

白 林1，范金钊2，蔡 乐1，徐风华1（1.解放军总医院药品保障中心，北京 100853；2.安徽蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233000）

目的：建立测定盐酸苯海拉明乳膏含量的方法。方法：采用HPLC法，色谱柱：Platisil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水-三乙胺（50∶50∶0.5）；检测波长：258 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱温：40 ℃。结果：盐酸苯海拉明与其它杂质峰分离良好。盐酸苯海拉明在125.0 ～ 1 000.0 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系（r = 1.000 0）；盐酸苯海拉明的平均回收率为98.18%，RSD = 0.40%（n = 9）。结论：本方法简便、准确、重复性好，可用于盐酸苯海拉明乳膏的含量测定。

高效液相色谱法；盐酸苯海拉明乳膏；含量测定

盐酸苯海拉明乳膏收载于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》[1]，具有抗过敏、止痒、消炎、消肿作用，临床上常用于治疗急性湿疹、皮炎及其他各种过敏性皮肤疾病。原含量测定方法为银量法和阴离子表面活性剂双向滴定法[1]，银量法测定的是氯离子的含量，专属性不强且突跃颜色不明显；阴离子表面活性剂双向滴定法中十二烷基硫酸钠溶液是一种表面活性剂，表面张力低，易从滴定管下漏，不易控制消耗毫升数，该法采用二甲基黄-溶剂蓝19混合指示液，滴定终点氯仿层由绿色转变为红灰色，颜色变化不明显，突跃点不易观察。两种方法准确度、灵敏度较低，本实验参考相关文献[2-7]采用HPLC法，快速、准确的测定了盐酸苯海拉明乳膏的含量，以期为有效控制其制剂质量提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪（包括四元梯度泵、自动脱气机、VWD检测器和化学工作站，美国安捷伦科技有限公司）；UV-2550型紫外分光光度仪（日本岛津公司）。

盐酸苯海拉明对照品（中国食品药品检定研究院，批号100066-200807）；乙腈为色谱纯，冰醋酸、三乙胺为分析纯。盐酸苯海拉明乳膏（本院制剂室提供，规格：20 g，批号20131223、20131230、20131231）；二苯酮（美国ChemService公司，批号727800）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Platisil C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水-三乙胺（50∶50∶0.5）用冰醋酸调至pH 6.5；检测波长：258 nm；柱温：40 ℃；流速：0.8mL·min-1；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

（1）对照品溶液：取盐酸苯海拉明对照品约0.250 0 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。取二苯酮对照品约0.014 8 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取上述储备液各1 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（含盐酸苯海拉明500 μg·mL-1、二苯酮14.8 μg·mL-1）。

（2）供试品溶液：取盐酸苯海拉明乳膏约1.25 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加流动相30 mL，置于50 ℃水浴加热振摇使溶解，放冷至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷藏1 h，取出，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

（3）阴性对照溶液：按处方比例取除盐酸苯海拉明以外的其余成分，按盐酸苯海拉明乳膏的制备工艺制成阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性实验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定。见图1。

图1 盐酸苯海拉明色谱图A – 对照品，B – 供试品，C – 阴性对照；1 – 盐酸苯海拉明，2 – 羟苯乙酯（防腐剂），3 – 二苯酮（苯海拉明分解产物）Fig 1 Chromatograms of diphenhydramine hydrochlorideA – reference substance, B – sample, C – negative reference substance; 1 – diphenhydramine hydrochloride, 2 – ethyl hydroxybenzoate (preservative), 3 – benzophenone (the decomposition product of diphenhydramine)

2.4 线性关系考察

吸取盐酸苯海拉明对照品溶液，含盐酸苯海拉明分别为125.0、250.0、500.0、750.0、1 000.0 μg·mL-1注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积值为纵坐标（Y），进样量（μg·mL-1）为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程：Y = 1.046 7 X + 1.011，r = 1.000 0。结果表明盐酸苯海拉明在125.0 ～ 1000.0 μg·mL-1的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续重复进样6次，记录峰面积值，盐酸苯海拉明RSD为0.08%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

取盐酸苯海拉明软膏（批号20131223）按“2.2”项下方法分别制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别进样10 μL，标示量%分别为100.90%、101.15%、100.45%、100.79%、101.17%、100.77%，RSD为0.27%（n = 6）。表明方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

取同一份供试品溶液分别于0、1、2、4、6、8 h进样10 μL，测定盐酸苯海拉明峰面积分别为528.5、528.2、528.5、528.4、528.9、527.7，RSD为0.08%。结果表明供试品溶液中盐酸苯海拉明在8 h内稳定。

2.8 回收率实验

按处方量称取处方中除盐酸苯海拉明以外的辅料，按制备工艺制成盐酸苯海拉明的阴性样品，取9份，分成3组，每组3份，每份约1.25 g。分别精密加入4.0、5.0、6.0 mL盐酸苯海拉明对照品溶液，按供试品溶液制备方法制成含量为标示量的80%、100%、120%的样品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图及峰面积，计算回收率。结果显示盐酸苯海拉明的平均回收率为98.18%，RSD = 0.40%。详见表1。

表1 盐酸苯海拉明乳膏回收率实验测定结果. n = 9Tab 1 Results of recovery test for diphenhydramine hydrochloride cream. n = 9

2.9 样品含量测定

取不同批号的样品各3份（批号20131223、20131230、20131231），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行含量测定，每份样品重复进样2次，详见表2。

表2 盐酸苯海拉明乳膏含量测定结果. n = 3Tab 2 Contents determination of diphenhydramine hydrochloride in diphenhydramine hydrochloride cream. n = 3

3 讨论

3.1 盐酸苯海拉明含量测定方法的选择

盐酸苯海拉明含量测定方法主要有硝酸银滴定法[1]、十二烷基硫酸钠滴定法[1]，紫外分光光度法[8]，HPLC法[2-5]等。硝酸银滴定法、十二烷基硫酸钠滴定法无需特殊仪器，但滴定终点变化不明显；紫外分光光度法，基质对测定结果的影响较大。有文献[2-7]采用HPLC法测定盐酸苯海拉明，可以有效避免基质对测定的干扰，操作简便，专属性强，结果准确，适用于医疗单位对该制剂进行质量控制。

3.2 HPLC法测定条件的优化

3.2.1 检测波长的选择将对照品溶液置紫外分光光度计上，在200 ～ 350 nm进行扫描，得盐酸苯海拉明的紫外光谱图。结果表明盐酸苯海拉明在258 nm处有最大吸收且不受杂质、辅料、溶剂的干扰，因此选择258 nm为盐酸苯海拉明的检测波长。

3.2.2 流动相的选择本实验曾用甲醇-1%三乙胺、乙腈-1%三乙胺[3-4]、甲醇-水-三乙胺[5]及不同比例的乙腈、水、三乙胺为流动相，在乙腈-水-三乙胺（50∶50∶0.5）[9-10]的条件下测定盐酸苯海拉明的含量不受杂质干扰，且峰形好，灵敏度高，重现性和回收率好，完全能满足该品种质量标准的要求，为其质量控制提供了可靠的定量方法参考。

3.2.3 溶剂的选择本实验曾以甲醇、乙醇、流动相分别作为溶剂提取盐酸苯海拉明，其中采用流动相作溶剂提取回收率高，且样品溶液进入色谱系统不会有不溶物质析出，因此用流动相作为提取剂。

3.2.4 色谱柱选择文献[9-10]测定盐酸苯海拉明采用氰基柱，本实验曾采用氰基柱进行试验，色谱柱冲洗及更换等操作繁琐，氰基柱用于反相条件时CN键易水解，尤其是在pH 1.5 ～ 7.0的范围以外，柱子使用寿命会下降较快。本实验采用常用ODS柱，不需频繁更换色谱柱，柱效与氰基柱基本相同。建立的含量测定方法快速、简捷、准确度高、重复性好，基质对测定无干扰，分离效果好，能很好的用于盐酸苯海拉明乳膏的含量测定。

3.3 稳定性影响因素

（1）光照：将实验配置的对照品溶液，置自然光照下，于0、3、6、9、12、24 h分别进样10 μL，记录峰面积分别为530.5、529.4、530.1、530.0、529.7、529.9。实验结果表明盐酸苯海拉明在24 h内几乎不受光照影响，实验过程中不必采取避光操作。

（2）酸性：文献[10]表明，盐酸苯海拉明经酸破坏会产生二苯酮杂质峰，本实验流动相pH 6.5为弱酸性。对照品溶液最终由流动相（pH 6.5）定容，结合光照实验，可知盐酸苯海拉明在pH 6.5溶液中较稳定，不干扰本实验含量测定结果。

（3）温度：本实验曾用不同水浴温度（50 ～ 80 ℃）进行试验，结果表明水浴温度对盐酸苯海拉明的稳定性无影响。

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Content determination of diphenhydramine hydrochloride cream by HPLC

BAI Lin1, FAN Jin-zhao2, CAI Le1, XU Feng-hua1(1. Department of Pharmaceutical Care, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. Bengbu Medical College, Bengbu 233000, China)

Objective:To establish the HPLC method for determining the content of diphenhydramine hydrochloride cream.Methods:HPLC analysis was carried out with Platisil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), the mobile phase consisted of acetonitrile-water-triethylamine (50 : 50 : 0.5), the detection wavelength was 258 nm, the fl ow rate was 0.8 mL·min-1and the column temperature was 40 ℃.Results:The samples were separated well from impurities by this HPLC method. The calibration curve of diphenhydramine hydrochloride was linear in the range of 125.0 – 1 000.0 μg·mL-1(r = 1.000 0). The average recovery and the RSD of diphenhydramine hydrochloride were 98.18%, 0.40% (n = 9), respectively.Conclusion:This method is accurate and feasible, which can be applied as the quantitative method for the determination of diphenhydramine hydrochloride cream.

HPLC; Diphenhydramine hydrochloride cream; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2014)06 – 0348 – 03

2014-03-03

2014-05-16）

总后制剂标准提高计划重点课题：半固体制剂标准提高系列研究（13ZJZ05）

徐风华，女，研究员，研究方向：药物新剂型与新型递药系统研究。E-mail：xufh@yahoo.com

白林，女，主任药师，研究方向：药物分析与药品质量控制。E-mail：bailin301@126.com