单纯形法优化花生根中白藜芦醇的微波提取工艺

彭翠红，麦康燕，谭乐茵，丘秀珍

单纯形法优化花生根中白藜芦醇的微波提取工艺

彭翠红，麦康燕，谭乐茵，丘秀珍

（韶关学院化学与环境工程学院，广东韶关512005）

采用微波提取与分子荧光分析技术，探索正交试验与改进单纯形试验设计相结合优化花生根中白藜芦醇的微波提取工艺.通过L9(34)正交试验考察料液比、微波功率、乙醇溶剂浓度以及微波提取时间等因素对白藜芦醇提取效果的影响，再采用改进单纯形试验进一步优化提取工艺.研究表明：结合正交试验与改进单纯形法提取花生根中白藜芦醇的最佳工艺条件为料液比1∶15（g·mL-1），微波功率中高火，微波时间5 min，乙醇浓度68%.在最佳工艺条件下白藜芦醇的平均提取率为0.151 5%，与单纯采用正交试验最优提取条件相比白藜芦醇的提取率提高了24.30%，有效地实现了花生根中白藜芦醇的最佳提取效果.

花生根；白藜芦醇；微波提取；改进单纯形设计法；正交试验

白藜芦醇(resveratrol)即3,4′,5-三羟基二苯乙烯（3,4′,5-trihydrolystilbene），是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物［1］，主要存在于葡萄、虎杖、桑葚、花生植株等植物中，是植物在恶劣环境下或遭到病原体侵害时自身分泌的天然植物抗毒素之一，其药理活性显著，高效低毒，具有抗氧化、抗肿瘤、防治心血管病等功能［2-5］，广泛应用于医药、食品、化妆品等行业，引起科研工作者极大的研究兴趣.

微波辅助提取白藜芦醇具有提取时间短，萃取效率高，溶剂用量少等特点.目前，探究其微波提取条件多采用正交试验和单因素控制法［6-7］，单纯形优化法是一种动态的寻优试验设计法，改进单纯形设计法特别适用于多因素间有交互作用的体系，能用较少次数试验迅速获得最佳工艺条件［8-9］.花生植株根部等废弃物是天然的白藜芦醇植物源，其白藜芦醇含量较高，笔者拟结合正交试验得出的最佳微波提取条件，采用改进单纯形设计法优选韶关产花生根中白藜芦醇的提取工艺，为高效、廉价提取白藜芦醇提供参考.

1 材料与方法

1.1仪器与材料

LS-55分子发光光度计（美国Perkin Elmer公司，Flour方式，激发狭缝：5.0 nm，发射狭缝：5.0 nm）；PJ21C-BF美的微波炉；AE240电子天平；DZF-6050D真空干燥箱；聚乙烯消解罐等.

花生根（产于广东省韶关市浈江区）：将新鲜采集的花生根洗净，真空干燥至恒重后，粉粹，过50目筛，低温保存.白藜芦醇标准品（纯度≥99%，美国Sigma公司）；无水乙醇（GR）；AlCl3等其余试剂均为分析纯；二次蒸馏水.

1.2测定方法

准确称取干燥至恒重的白藜芦醇标准品0.008 0 g，用乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，用无水乙醇配制成80μg·mL-1白藜芦醇标准溶液.量取适量的白藜芦醇乙醇标准液，加入1.00 mL浓度为50 g/L的AlCl3溶液至25 mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，静置40 min后，以乙醇为参比，于分子发光光度计上测定其荧光强度If，得荧光光谱如图1所示，其最大激发波长λEx和最大发射波长λEm分别为321.0 nm和380.0 nm.

分别准确吸取该标准溶液0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mL于25 mL容量瓶中，按以上方法配制不同浓度标准液，在λEx/λEm=321.0 nm/380.0 nm处测定其荧光强度If，以白藜芦醇荧光强度If对质量浓度作标准曲线，如图2所示，白藜芦醇的浓度在0～8.41×10-6mol/L范围内与其荧光强度If呈良好的线性关系，线性回归方程为If=370.759 c(μg·mL-1)+7.238，相关系数r=0.999 7.

准确吸取适量的花生根提取液，按分子荧光分析法测定样品中白藜芦醇的含量，计算花生根中白藜芦醇的提取率：

c：由回归方程计算白藜芦醇浓度（μg·mL-1）；V：滤液体积（mL）；D：稀释倍数；ms：花生根样的质量（g）.

图1 白藜芦醇标准品的荧光光谱

图2 白藜芦醇测定的标准曲线

1.3微波提取花生根中的白藜芦醇

准确称取1.000 g花生根样品置于50 mL微波消解瓶中，加入一定浓度的乙醇溶剂后放入微波炉内，设定适当的微波时间及微波功率加热提取，微波提取结束后取出，静置冷却20 min，减压过滤合并滤液，取滤液稀释适当倍数后利用分子荧光分析法测定样品中白藜芦醇含量，并计算白藜芦醇的提取率.

1.4花生根中白藜芦醇微波提取工艺的优化

1.4.1 正交试验法

选取料液比、微波时间、乙醇浓度以及微波功率4个因素，采用L9(34)正交试验确定最佳提取工艺，考察各种提取参数对花生根中白藜芦醇提取效果的影响.L9(34)正交试验考察的因素和水平见表1.

表1 微波提取法正交试验的因素和水平

1.4.2 改进单纯形试验法

在正交试验结果的基础上，固定料液比为1∶15（g·mL-1），结合正交试验所得的最优提取条件：微波功率中火、乙醇浓度70%、微波时间6 min，将微波功率、乙醇浓度、微波时间的步长分别设为0.5档位、5%、0.5 min，利用U4(43)均匀设计法构成提取白藜芦醇初始单纯形进一步试验优化提取工艺.初始单纯形各试验点见表2.

2 结果与讨论

2.1 正交试验优化提取工艺

选取料液比、微波时间、乙醇浓度以及微波功率4个因素及三个水平作正交试验，对花生根中白藜芦醇的微波提取工艺进行优化，L9(34)正交试验设计及直观分析结果见表3.

表2 U4(43)均匀设计构成初始单纯形各试验点

表3 L9(34)正交试验方案和结果分析

根据极差分析，RD＞RC＞RB＞RA，即影响微波提取花生根中白藜芦醇效果的主次因素顺序为：料液比＞微波功率＞乙醇浓度＞微波时间.由测定结果得微波提取花生根中白藜芦醇最优工艺条件是D2C1B3A2，即料液比为1∶15（g·mL-1），微波功率为中火，乙醇浓度为70%，微波时间为6 min.根据K值的变化规律分析，料液比是影响白藜芦醇提取效果的主要因素，料液比稍高有利于白藜芦醇的提取；微波处理时间短，提取不充分，时间过长，由于白藜芦醇是热不稳定性物质，会导致白藜芦醇分解而使提取率下降；微波功率越大温度升高越快，温度过高会影响提取率，这可能与白藜芦醇的热不稳定性有关，而微波功率过低，白藜芦醇提取不充分导致提取率偏低；提取时间短，乙醇浓度较高时有助于白藜芦醇的快速溶出，原因是根据“相似相溶”的原理乙醇浓度稍高，溶剂极性与白藜芦醇极性越接近，越有利于白藜芦醇溶解.

优化条件验证：准确称取花生根1.000 g，用70%乙醇溶液按料液比1∶15（g·mL-1），中火微波萃取6 min，微波提取后静置冷却20 min，过滤合并滤液，储放在棕色容量瓶.移取适量滤液按1.2方法测定白藜芦醇含量.重复试验5次，计算在此最佳条件下得到的花生根中白藜芦醇含量为1 218.6μg/g，均高于上述正交试验最大值.计算平均提取得率为0.121 9%，RSD为0.83%.

2.2改进单纯形试验优化提取工艺

单纯形是由n维空间的(n+1)个顶点（试验点）所构成的凸多边形，空间维数就是在试验设计中所考虑的影响因素数.改进单纯形法是在基本单纯形优化法的基础上，引入了反射、扩展与收缩等操作规则，变固定步长为可变步长推移单纯形，在保证优化精度的条件下，加快优化速度［10-11］.

在单纯形的推移过程中，新试验点在空间的位置坐标按以下方法计算［10-11］：

a：反射系数；n：因素数.

采用改进单纯形试验对花生根中白藜芦醇的提取工艺进行优化，试验设计及结果如表4所示.

表4 改进单纯形试验结果及其推进

由表4可知，4个初始试验点中，按第4号试验条件提取得到的白藜芦醇量最少，故以试验点4作为最坏点，利用对称反射原理得新试验点5，测得结果较高，并与试验点1、2、3结果进行比较，其中试验点3作为最坏点，取其反射点6，其结果均低于试验点1、2、5，故返回试验点5，取反射系数a=1.5扩大，其试验结果大于试验点4，再以试验点2作为最坏点进行推进，得新试验点8的结果均低于试验点1、5、7.经过单纯形试验的动态调优，试验点5的条件为最优，即微波提取花生根中白藜芦醇的最佳工艺为：微波功率中高火，微波时间为5 min，乙醇浓度为68%.重复试验5次，计算该提取条件下得到的花生根中白藜芦醇平均量为1 514.7μg/g，计算平均提取得率为0.151 5%，RSD为0.50%.

通过单纯形试验与正交试验的结果比较表明，花生根中白藜芦醇的提取条件得到了明显的优化，样品中白藜芦醇的提取率有了较为明显的提高，与正交试验相比白藜芦醇的提取率提高了24.30%.

2.3加标回收试验

为验证本方法，在样品中加入白藜芦醇标样进行回收试验，样品的加标回收率在95.20%～96.20%之间，结果见表5.由此可见本文所用的优化提取工艺方法可行，适用于提取花生根中的白藜芦醇.

表5 白藜芦醇加标回收试验结果

3 结论

在正交试验所得最优提取条件基础上，利用均匀设计法确定改进单纯形设计法的初始试验点，经过优化推进后，得微波提取花生根中白藜芦醇的最佳工艺为乙醇浓度为68%，料液比1∶15（g/mL），微波功率为中高火，微波时间为5 min，与单纯采用正交试验相比白藜芦醇的提取率提高了24.30%.结合正交试验和改进单纯形设计法寻找微波提取花生根中白藜芦醇的最佳条件，相比于单纯正交试验，优化效果更明显，此方法简便快速、准确，能够在较短时间内使工艺条件得到优化.

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Simplex method to optimize microwave-assisted extraction of resveratrol in root of peanut

PENG Cui-hong,MAI Kang-yan,TAN Le-yin,QIU Xiu-zhen
（Schoolof Chemistry&Environmental Engineering,Shaoguan University,Shaoguan 521005,Guangdong,China）

By microwave extraction and molecular fluorescence analysis,a new microwave extraction process condition of resveratrol in root of peanut is made through combining with orthogonal test and the improved simplex method.Adopting the method oforthogonaltestwith L9(34),the influencing factors ofextraction conditions for extracting resveratrol in root of peanut were discussed,such as solid-liquid ratio,microwave temperature, concentration of ethanol solvent and microwave time.And then further optimization of extraction process with the improved simplex test.The results show that the optimum technology conditions for extracting resveratrol in rootofpeanut by microwave extraction method and improved simplex method are as follows:the ratio ofmaterial to liquid was 1∶15（g·mL-1）,microwave power of middle high fire,extraction time of 5 min,volume fraction of ethanol was 68%.With these conditions,the extraction rate of resveratrol from the root of peanut is 0.151 5%. Compared with only use orthogonal experiment,the extraction rate is increased by 24.30%.It can obtain the best extraction conditions of resveratrol from the rood of peanut.

root of peanut;resveratrol;microwave-assisted extraction;the improved simplex method;orthogonal experiment

O657.36

A

1007-5348（2014）04-0051-05

（责任编辑：李婉）

2014-03-12

韶关学院大学生创新创业训练计划立项项目（韶学院〔2013〕63号Sycxcy2013—108）.

彭翠红（1968－），女，湖北武汉人，韶关学院化学与环境工程学院高级实验师，主要从事分子光谱分析研究.