松木层孔菌多糖PP60-S1分离、结构表征及抗氧化活性研究

杨 开，金月忠，邢 辰，胡江宁，王如伟，孙培龙，*

（1.浙江工业大学食品科学与工程系，浙江杭州 310014；2.浙江中药与天然药物研究院，浙江杭州 310052）

松木层孔菌多糖PP60-S1分离、结构表征及抗氧化活性研究

杨 开1，2，金月忠1，邢 辰1，胡江宁2，王如伟2，孙培龙1，*

（1.浙江工业大学食品科学与工程系，浙江杭州 310014；2.浙江中药与天然药物研究院，浙江杭州 310052）

松木层孔菌子实体水提物经乙醇分级醇沉和DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析及Sephacryl S-300凝胶柱层析纯化，获得均一多糖PP60-S1，其分子量为3.56×104u，是由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成的杂多糖，单糖摩尔比为9.24∶1.00∶0.76，甲基化分析PP60-S1主要由1-Glc、1，3-Glc、1，6-Glc、1，3-Gal、1，6-Gal、1，3，6-Man 6种糖苷键连接方式，主链主要由1，6-Glc构成。PP60-S1的体外抗氧化活性研究表明其具有一定的DPPH自由基和ABTS+自由基清除活性以及FRAP总抗氧化能力。

松木层孔菌，多糖，分离纯化，结构表征，抗氧化

松木层孔菌（Phellinus pini），又名松针层孔菌和松白腐菌，是针层孔菌属真菌，属于大型真菌，子实体木质，呈褐色。其主要活性成分有多糖、酚类、萜类物质等[1-2]。多糖作为松木层孔菌的主要生物活性成分之一，在抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等方面均表现出了较好的效果[3-4]。在松木层孔菌发酵物多糖研究方面，裴丽娟等[5]从发酵菌丝体中分离得到了一种由甘露糖、半乳糖和葡萄糖构成的碱提水溶性多糖（PEP），此多糖对小鼠离体淋巴细胞具有较显著的促增殖作用。袁蕾等[6]从发酵液中分离得到了一种胞外多糖（PPE），是以甘露糖（93.29%）为主要组成的杂多糖组分。在子实体多糖研究方面，刘安军等[7]提取分离得到的水溶性β-杂多糖组分PS1，能够显著提高小鼠机体的免疫能力。Lee等[8]从松木层孔菌子实体中分离得到了两种高分子量的多糖（EP-AV1和EP-AV2），均以β-1，3葡聚糖构成为主，并具有一定的抗病毒活性（包括HSV-1和CVB3）。近几十年的研究表明，一种来源的菌物多糖往往由几个不同结构的多糖组成，而且多糖的结构（如分子量、连接方式、糖苷键类型、分支度和聚合度等）是其发挥各种生理活性的物质基础。然而与同属的其他真菌相比，如裂蹄 针 层 孔 菌（Phellinus linteus）、针 层 孔 菌（Phellinus igniarius）和鲍氏针层孔菌（Phellinus baumii），目前有关松木层孔菌多糖结构特性的研究还很少。因此，本文进行了松木层孔菌子实体多糖的提取和分离纯化，并对一个纯化多糖组分开展了结构表征和体外抗氧化活性研究，有利于进一步了解该珍稀菌物多糖的结构和生物活性，也为其医药保健产品的研发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

松木层孔菌子实体（Phellinus pini） 购于浙江五养堂药业有限公司，由浙江省农科院园艺研究所食药用菌研究室蔡为明研究员鉴定；DEAE-Sepharose Fast Flow 、Sephadex G-25 Fine 和 Sephacryl S300 High-Resolution 均购自美国GE公司；葡聚糖标准品（analytical standard for GPC，CAS：9004-54-0）、单糖标准品：L-岩藻糖（≥99%，CAS：2438-80-4）、D-木糖（≥99%，CAS：58-86-6）、D-甘露糖（≥99%，CAS：3458-28-4）、L-鼠李糖 （≥99%，CAS：10030-85-0）、D-半乳糖（≥99%，CAS：59-23-4）、D-葡萄糖（≥99.5%，CAS：50-99-7）、碘甲烷、2，2-Diphenyl-picrylhydrazyl（DPPH）、2，2-Azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt（ABTS）、2 ，4 ，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine（TPTZ） 均 购 自 美 国 Sigma公司；三氟乙酸、硼氢化钠 购于德国Merck公司；其余试剂 均为国产分析纯。

RE-2000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；CR21GⅡ型高速冷冻离心机 日本日立仪器有限公司；UV-2450紫外可见分光光度仪 日本岛津公司；Alpha 2-4 LD Plus真空冷冻干燥机 德国Christ公司；Waters 1525高效液相色谱仪、Waters 2414示差检测器 美国Waters公司；TSKgel G4000PWXL高效液相色谱柱 日本Tosoh公司；XK双层层析柱（26mm× 100cm） 美国GE公司；Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪、Finnigan Trace Ultra-DSQⅡ气-质联用色谱仪 美国Thermo公司；Agilent 7890A气相色谱 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 松木层孔菌子实体多糖的提取 松木层孔菌子实体切成小块后用粉碎机粉碎，过60目筛，60℃烘干至恒重，称取干燥粉末500g，用10倍体积95%乙醇浸提过夜脱脂，布氏漏斗过滤，重复3次。残渣置阴凉通风处风干，加20倍蒸馏水，沸水提取2h，10000r/min离心10min，渣液分离，滤渣复提2次，合并3次提取液，50℃以下减压旋转蒸发浓缩，浓缩液搅拌过程中缓慢加入95%乙醇至终乙醇体积浓度为30%，静置过夜，10000r/min，离心10min；上清液继续加入95%乙醇至终乙醇体积浓度为60%，10000r/min，离心10min，收集沉淀，醇沉物再经无水乙醇、丙酮洗涤，72h冷冻干燥后得松木层孔菌子实体粗多糖，命名为PP60。

1.2.2 松木层孔菌子实体多糖的分离与纯化 将粗多糖PP60溶于蒸馏水中，配成1.0mg/mL溶液，10000r/min离 心10min，取 上 清 液 经 DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱（XK26mm×100cm）层析，每次上样10mL，流速3.0mL/min，依次用蒸馏水，0～0.4mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，自动部分收集，每管10mL，糖含量经苯酚-硫酸法跟踪检测，根据显色反应收集多糖组分。离子柱洗脱下来的多糖组分PP60-S配成一定浓度的糖 溶 液 后 经Sephadex G-25 Fine凝 胶 柱（XK26mm × 100cm）脱盐，收集全部脱盐后的PP60-S多糖溶液 ，再 用 Sephacryl S-300 High-Resolution 凝 胶 柱（XK26mm×100cm）进一步纯化，蒸馏水洗脱，自动部分收集，得到PP60-S1组分，收集，浓缩，冻干，储存于干燥器中备用。

1.2.3 多糖PP60-S1的均一性和平均分子量测定 采用高效液相色谱法（HPLC）对松木层孔菌纯化多糖PP60-S1进行均一性及分子量的测定。色谱柱：TSKgel G4000PWXL（7.8 ×300mm）；流 动 相 ：0.1mol/L NaNO3溶液，流速：0.8mL/min；进样量：10μL；柱温：（30±1）℃；检测器：Waters 2414示差检测器。取多糖PP60-S1 2.0mg溶于2.0mL 0.1mol/L NaNO3溶液，微孔滤膜过滤，取滤液10μL进样，测得保留时间，根据标准曲线计算分子质量。

1.2.4 多糖PP60-S1的理化特性分析

1.2.4.1 多糖PP60-S1的紫外-可见光光谱全扫描检测 将PP60-S1配成1.0mg/mL水溶液，采用紫外-可见分光光度计在200～400nm进行全波长扫描检测。

1.2.4.2 多糖PP60-S1的傅里叶变换红外光谱分析 取2.0mg干燥的PP60-S1样品，采用KBr压片，在4000～400cm-1内进行红外光谱扫描。

1.2.5 多糖PP60-S1的单糖组成分析 称取PP60-S1样品2.0mg，放入薄壁长试管中，加入2.0mol/L的三氟乙酸（TFA）4.0mL，在110℃水解2h。水解后，试管中溶液低于40℃减压蒸干，然后加入甲醇蒸干，重复操作4～5次，以完全除去TFA。将完全水解的样品重新溶于3.0mL蒸馏水中，加入20～30mg硼氢化钠（NaBH4），密塞，室温下还原3h，然后用冰醋酸中和过量的NaBH4，加入少量甲醇，减压浓缩蒸干，重复4～5次，真空干燥过夜。次日，加入4.0mL醋酐，100℃反应1h，然后加入3.0mL甲苯，减压蒸干。将乙酰化后的产物用氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入等量的蒸馏水充分混匀，静置分层后，除去上层水溶液，重复3～4次。氯仿层以适量无水硫酸钠干燥、过滤，定容至10mL，待GC分析。

色谱条件：Agilent 7890N仪器配备HP-5毛细管柱（30m ×0.32mm ×0.25μm），氢 火 焰 离 子 化 检 测 器（FID），高纯度氮气最为载气。程序升温：初始柱温为120℃，以10℃/min升温至240℃，恒温6.5min，进样量2.0μL，进样口温度为250℃，分流比1∶50，检测器温度为250℃，氢气流速为35mL/min，空气流速350mL/min，尾吹气流速30mL/min，柱内流速为1.0mL/min。

1.2.6 多糖PP60-S1的糖苷键连接方式分析 充分干 燥 的 样 品 2.0mg，加 入 0.5mL DMSO，水 浴 超 声2min，然后加入0.025g/mL NaOH-DMSO悬液0.6mL和0.6mL碘甲烷，密封、涡旋混合器上混合7min后加入4.0mL蒸馏水终止反应，用等量的氯仿进行萃取，弃去上层水相，下层有机相用蒸馏水萃取5次，有机相40℃下减压蒸干，用IR检查至3400cm-1处无-OH吸收峰，即得完全甲基化多糖。将甲基化多糖溶于甲酸溶液中，100℃下解聚3h。再用TFA在100℃下封管水解6h后用NaBH4进行还原，再将上述处理过的样品用醋酐进行乙酰化反应。乙酰化后的产物用等体积氯仿和蒸馏水进行萃取，待GC-MS分析。

色谱条件：Finnigan Trace Ultra-DSQⅡ气-质联用色谱仪配备DB-5毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。程序升温：初始柱温为120℃，以10℃/min升温至240℃，保持6.5min，接口温度为250℃，离子源温度为250℃，进样量2.0μL，以氦气做载气，流速为1.0mL/min。

1.2.7 多糖PP60-S1的体外抗氧化活性测定

1.2.7.1 清除DPPH自由基活性测定 测定方法参考Milardovic等[9]的报道并略有改动。用80%甲醇溶液配制成0.2mmol/L的DPPH试剂，取1.0mL稀释的提取液与3.0mL DPPH试剂混合，暗处反应1h，然后在515nm下测定吸光值。以80%甲醇溶液作为空白对照。其结果表达为清除率达到50%时所对应的多糖浓度（即EC50）。

式中：A0：空白对照的吸光值；A1：样品的吸光值。

1.2.7.2 清除ABTS+·活性测定 测定方法参考Miller等[10]的报道并略有改动。取140mmol/L的过硫酸钾溶液加入到7.0mmol/L的ABTS溶液中混合，暗处反应12～16h。测定前用无水乙醇将ABTS+·溶液稀释至吸光值为0.70±0.02（734nm）。取0.2mL稀释过的提取液与 3 .8mL 的 ABTS+·溶 液 混 合 摇 匀 ，在 室 温 下 反 应10min后，在734nm下测定吸光值。以80%甲醇溶液作为空白对照。其结果表达为清除率达到50%时所对应的多糖浓度（即EC50）。清除率公式同1.2.7.1。

1.2.7.3 FRAP总抗氧化活性测定 测定方法参照Benzie等[11]的 报 道 并 略 有 改 动 。FRAP 试 剂 的 准 备 ：0.1mol/L的醋酸缓冲试剂（pH3.6），19mmol/L的TPTZ，20mmol/L氯化铁按体积10∶1∶1的体积比混合。3.9mL FRAP试剂工作液加入0.1mL稀释过的提取液，混合均匀，置37℃恒温水浴10min，然后在593nm下测其吸光值。以FeSO4为标准溶液（标准曲线：y=0.5450x-0.0031，R2=0.9992），根据反应后的吸光值，在标准曲线上求得相应的FeSO4的浓度，定义为FRAP值，结果以每毫克多糖相当FeSO4还原力的相当量表示（mmol FeSO4/mg多糖），FRAP值越大，抗氧化活性越强。

1.2.8 数据处理 所有实验数据重复测定3次，所得结果 以 平均 值 ±标 准 差（±s）来 表示，采用Origin 8.5软件进行绘图与数据的分析。

2 结果与分析

2.1 松木层孔菌多糖PP60-S1的分离纯化

经乙醇脱脂的松木层孔菌子实体粉末，热水浸提，乙醇沉淀后得到粗多糖PP60，其得率为6.29%（w/w），经苯酚-硫酸法测定，总糖含量为66.32%±3.61%。PP60 经DEAE-Sepharose Fast Flow离 子 柱 层 析 后 得到3个组分：PP60-W（蒸馏水洗脱）、PP60-S（0.1mol/L NaCl溶 液 洗 脱）和PP60-S-1（0.2mol/L NaCl溶 液 洗脱）。洗脱曲线如图1所示。收集含量较多组分PP60-S，经Sephadex G-25 Fine凝胶柱脱盐后，再经Sephacryl S-300 High-Resolution（图2）进一步纯化后得到纯化组分PP60-S1，收集、浓缩、冷冻干燥后得到白色固体粉末。

图1 PP60 DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析洗脱曲线Fig.1 Elution curves of PP60 by DEAE-Sepharose Fast Flow column chromatography

图2 PP60-S脱盐后Sephacryl S300洗脱曲线Fig.2 Elution curves of desalted PP60-S by Sephacryl S300 column chromatography

2.2 多糖PP60-S1的纯度及平均分子质量测定结果

标准曲线用标准葡聚糖（分子量分别为1.0、5.0、12、50、80、150、270、670ku） 的保留时间进行绘制。以分子量的对数为纵坐标（y），保留时间为横坐标（x，min），绘制得标准曲线：y=-0.4925x+10.071，R2= 0.9953。

PP60-S1经HPLC检测为单一对称峰（图3），说明PP60-S1为均一多糖，根据保留时间及标准葡聚糖分子量曲线，计算其平均分子质量为3.56×104u。经苯酚-硫酸法测定，PP60-S1总糖含量为99.07%± 0.28%。

图3 PP60-S1 HPLC曲线Fig.3 HPLC determination of PP60-S1

2.3 紫外-可见光光谱全扫描检测结果

松木层孔菌多糖PP60-S1的紫外-可见光谱全扫描结果见图4所示。其显示在210nm波长左右处有强的多糖吸收峰，而在260nm和280nm波长处未发现核酸和蛋白质等杂质峰，表明PP60-S1不含核酸和蛋白质。

图4 PP60-S1紫外全扫描光谱图Fig.4 UV scanning curve of PP60-S1

2.4 傅里叶变换红外光谱分析

PP60-S1在4000～400cm-1区具有多糖官能团特征吸收峰（图5）。由图5可见，3412.8cm-1的宽而强的吸收峰是糖分子中-OH基团的伸缩振动吸收峰；2928.0cm-1的吸收峰是C-H的伸缩振动峰；1658.0cm-1附近的吸收峰是多糖的水合振动峰；1378.8cm-1左右的吸收峰是C-H的弯曲振动吸收峰；1076.5cm-1的吸收峰为C=O伸缩振动特征峰，包括吡喃糖环的C-O-C伸缩振动和吡喃环中与羟基连接的C-O伸缩振动，说明其中的单糖以吡喃糖苷的形式存在[12-13]；1730cm-1及1258cm-1附近没有特征吸收峰，表明该糖不含糖醛酸[14]。

图5 PP60-S1的红外光谱图Fig．5 FT-IR spectrum of PP60-S1

2.5 多糖PP60-S1的单糖组成分析

混合单糖标准品和PP60-S1乙酰化衍生物气相色谱图见图6。根据图6（b）得出，多糖PP60-S1组成单糖有三种，与标准单糖保留时间对比图6（a），根据保留时间顺序为甘露糖、葡萄糖和半乳糖，葡萄糖含量明显大于甘露糖和半乳糖。样品中三种糖的摩尔比为甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.00∶9.24∶0.76。这一结果与文献报道的松木层孔菌发酵菌丝体胞外多糖（主要由甘露糖组成）相比存在明显的差异[6]。

图6 乙酰化衍生物气相色谱图Fig.6 Gas chromatogram of acetyl derivatives

2.6 多糖PP60-S1的糖苷键连接方式分析

PP60-S1经甲基化、酸水解、还原及乙酰化，生成甲基化糖醇乙酸酯衍生物，对其进行GC-MS分析。根据相应保留时间的碎片离子峰和相关文献[15-19]对比得出PP60-S1的甲基化多糖及单糖连接位点归纳如表1所示。甲基化糖醇衍生物中占绝大部分的为2，3，4-Me3-Glcp，说明多糖PP60-S1分子的主链可能主要是通过1，6葡萄糖糖苷键连接组成，而且结构中还存在末端Glc。计算得到的甲基化单糖摩尔比与GC分析得出的单糖摩尔比基本符合，主要由葡萄糖组成，证明推断合理。从1-Glc和1，3，6-Man的摩尔比（1∶1）看，两者可能是相互连接的。

2.7 多糖PP60-S1的体外抗氧化活性测定结果

多糖PP60-S1的体外抗氧化活性结果见表2。结果发现在实验的浓度范围内，松木层孔菌多糖PP60-S1对DPPH和ABTS+·自 由 基 的 清 除 率 均 随 浓 度 增加而增加，呈量效关系，对DPPH自由基的半清除浓度（EC50）为 4.18mg/mL；对 ABTS+·自 由 基 的 半 清 除 浓度（EC50）为7.62mg/mL；反映总抗氧化能力的FRAP值为0.18mmol FeSO4/mg多糖。通过体外抗氧化活性的研究，发现松木层孔菌子实体纯化多糖PP60-S1具有一定的清除DPPH和ABTS+自由基活性和FRAP总抗氧化能力，但不及文献报道的松木层孔菌子实体粗多 糖 体 外 抗 氧 化 活 性[20]，其 原 因 可 能 与 提 取 的 粗 多糖（未经纯化）连有蛋白质、核酸、酚类化合物等其他 活 性 成 分[21-22]有 关 ，其 具 体 原 因 需 要 进 一 步 研 究证实。

表1 松木层孔菌多糖PP60-S1的甲基化分析结果Table 1 Methylation analysis of Phellinus pini polysaccharide PP60-S1

表2 松木层孔菌多糖PP60-S1体外抗氧化活性结果Table 2 In vitro antioxidant activities of Phellinus pini polysaccharide PP60-S1

3 结论与讨论

真菌多糖主要存在于真菌子实体、菌丝体和发酵培养液中，并具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗衰老、免疫调节、降血压、降血脂、降血糖等。作为一种天然的生物大分子，真菌多糖因其优良的生物活性和无毒性的特点，成为了生物学和医学领域的研究热点。本实验通过对松木层孔菌子实体粗多糖的提取和分离纯化，获得了一种均一性较好的水溶性多糖PP60-S1，此多糖主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成，其摩尔比为9.24∶1.00∶0.76。与文献已报道的松木层孔菌发酵菌丝体碱提多糖[5]和胞外多糖[6]（主要由甘露糖组成）相比存在明显的差异，与刘安军[7]和Lee等[8]提取到的子实体多糖单糖组成较相符。经甲基化和GC-MS初步分析，PP60-S1主要由1，6-Glc构成，还存在少量其他的糖苷键，与Lee等得到的多糖组分EP-AV1和EP-AV2（以β-1，3葡聚糖为主）有一定的差别。另外，通过3种体外实验模型研究了松木层孔菌子实体多糖PP60-S1的体外抗氧化活性。结果表明，多糖PP60-S1对DPPH自由基和ABTS+自由基均表现出一定的清除活性以及FRAP总抗氧化能力。目前有研究表明，对具有抗氧化活性的多糖进行硫酸化、硒化及酯化等结构修饰和改造后，所得的修饰多糖抗氧化活性将会有较大的改善[23-24]，因此通过对松木层孔菌多糖结构进行改造和修饰，有望得到一种更加安全高效和经济实用的天然抗氧化剂产品，对于松木层孔菌资源的开发利用具有一定的意义。

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Study on isolation，structural characterization and antioxidant activity evaluation of polysaccharide PP60-S1 from Phellinus pini

YANG Kai1，2，JIN Yue-zhong1，XING Chen1，HU Jiang-ning2，WANG Ru-wei2，SUN Pei-long1，*
（1.Department of Food Science and Technology，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.Zhejiang Chinese Traditional Medicine and Natural Drug Research Institute，Hangzhou 310052，China）

The homogeneous polysaccharide PP60-S1 was obtained by water extraction ，ethanol precipitation and purified by DEAE-Sepharose F.F.and Sephacryl S-300 from the fruiting bodies of Phellinus pini.The polysaccharide PP60-S1 was composed of glucose，mannose and galactose with a molar ratio of 9.24∶1.00∶0.76，with an average molecular weight of 3.56 ×104u.The results of methylation analysis indicated that six kinds of glycosidic linkages were detected in the structure of PP60-S1：1-Glc、1，3-Glc、1，6-Glc、1，3-Gal、1，6-Gal、1，3，6-Man，respectively.The main chain contained mainly 1，6-Glc.Otherwise，the polysaccharide PP60-S1 exhibited a certain degree of antioxidant activity ，evaluated by in vitro assay of DPPH·， ABTS+· and ferricreducing antioxidant power（FRAP）.

Phellinus pini；polysaccharide；purification；structural characterization；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2014）20-0076-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.008

2014－02－24

杨开（1978-），男，博士，副研究员，研究方向：生物活性物质提取分离与结构表征。

* 通讯作者：孙培龙（1964-），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：食品化学与资源利用。

浙江省自然科学基金资助项目（LY13C200011）；国家科技支撑计划资助项目（2013BAD16B07）。