小分子物质的非竞争免疫分析方法最新研究进展

陈 波，何庆华，许 杨,*

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南 昌 330047）

小分子物质的非竞争免疫分析方法最新研究进展

陈 波1,2，何庆华1,2，许 杨1,2,*

（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西 南 昌 330047）

小分子物质（即半抗原）因分子质量小、抗原表位单一，其免疫学分析方法目前多为竞争型，然而非竞争型的分析灵敏度、精确度和线性范围均优于竞争型。本文介绍了近几年小分子物质的非竞争免疫分析方法的最新研究进展，重点阐述了各 类分析方法的原理、特点及应用，并对小分子物质的非竞争免疫学分析方法的发展趋势进行了展望。

非竞争免疫分析；半抗原；特殊抗体

小分子物质（如生理激素、农兽药残留、生物毒素等）的快速灵敏检测技术在临床医学诊断、环境监测、食品安全控制等领域具有重大意义。近年来，国内外已建立了一系列针对小分子的高灵敏度的仪器检测方法，如高效液相色谱[1]、气相色 谱[2]、色谱-质谱联用[3]和表面等离子共振[4]等，但该类方法需要较昂贵的仪器设备和专业操作人员，且样品常常需要特殊处理，耗时费力。基于抗原抗体特异性结合的免疫分析技术在确保检测灵敏度的前提下，具有简便快速、廉价和高通量筛选等优点，有利于基层检测机构的推广运用，因而成为目前研究热点之一。

免疫分析有竞争和非竞争两种基本形式，应用于小分子物质检测的主要是竞争分析形式。竞争型免疫分析灵敏度主要受抗原抗体亲和力的限制[5]，只有当抗体的亲和力常数（Ka）超过1011L/mol才能使检测限达到飞摩尔水 平，但通过传统的制备抗体技术亲和力常数很难超过1010L/mol[6]。非竞争型免疫分析理论上比竞争性具有更高灵敏度、精密度和线性范围[7]，被分析物的含量与检测信号在竞争型免疫分析中呈负相关，而在非竞争型免疫分析中呈正相关，图1直观地说明了非竞争型免疫分析在检测灵敏度方面的优越性。双位点分析已经被广泛应用于蛋白质、多糖等具有多个抗原表位的大分子物质的检测[8]，然而其并不适用于小分子物质，因为小分子物质（即半抗原）不能够同时提供两个或两个以上的表位结合抗体。近20 年，研究者们不断创新以克服这个困难，已建立了一些非竞争型免疫检测小分子物质的方法，包括基于化学修饰半抗原[9-10]、特殊分离仪器[11]和特殊抗体等。

图1 非竞争型分析和竞争型分析灵敏度的对比[12]Fig.1 The different sensitivities between competitive immunoassay and noncompetitive immunoassay[12]

本文主要就近年来国内外建立的基于小分子物质非竞型争免疫分析最新研究进展进行了评述，并对其发展趋势进行了初步展望。

1 基于抗独特型抗体非竞争型检测小分子

抗独特型抗体（anti-idiotype antibody，AId或Ab2）是机体针对抗体可变区产生的特异性抗体，能够作为抗原的替代物，因而被称为抗原分子的“内影像”，可以模拟抗原分子的三维结构。α-AId能够识别抗体分子上抗原结合位点以外的独特位，即识别抗体可变区上的框架区相关的独特位，且与半抗原-抗体间的结合互不干扰。而β-AId识别抗体上抗原结合位点，即与抗原分子具有相同的抗原决定簇，能与半抗原分子竞争结合抗体的抗原结合位点。当β-AId与抗体结合形成复合物后，由于空间阻碍的存在，α-AId不能结合β-AId/Ab1复合物。基于抗独特型抗体，Barnard等[13]建立了血清中雌二醇的非竞争检测方法，并将这种非竞争检测模式称为“Idiometric Assay”如图2，其检测信号强度与目标分析物的浓度成正比。Kobayashi等[5]利用磁珠分离与抗独特型抗体结合检测11-脱氧皮质醇，最低检出限达到了70 amol/assay。最近Niwa等[14]将抗皮质醇单克隆抗体与KLH偶联免疫小鼠，制备了α-和β-抗独特型抗体，建立了皮质醇的非竞争型免疫检测方法，结果表明该方法的灵敏度比传统竞争型方法提高了3 倍，并具有很好的特异性，适用于尿液中皮质醇的检测。

建立基于抗独特型抗体非竞争型检测方法需同时制备获得3 种抗体（抗半抗原抗体Ab1、独特型抗体α-AId和β-AId），尤其是抗独特型抗体的筛选和鉴定过程非常复杂，近年这方面的研究很少。不过，近年来不断发展的抗体库技术，为制备和筛选鉴定抗独特型抗体提供了一条有效的解决途径[15]。另外，采用商业化的噬菌体展示肽库淘选抗原模拟表位，建立无毒竞争检测小分子已经有很多报导[16]，但是还未见关于模拟表位肽与抗体结合后是否会对α-AId与抗体的结合产生空间位阻的研究报道。

图2 基于抗独特型抗体的免疫检测技术基本原理[17]Fig.2 Principle of anti-idiotype antibody based immunoassay[17]

2 基于抗体可变区片段非竞争检测小分子

Ueda等[18]报道了基于抗体可变区片段建立的一种新的非竞争免疫检测方法，即开放夹心式免疫分析（open sandwich immunoassay，OSIA），见图3，其理 论依据是游离的VH和VL之间的相互作用是非常微弱的，在低浓度下它们趋向于解离，然而加入相应的抗原后，VH与VL会通过抗原的“桥梁”作用而提高它们间的相互结合的亲和力和稳定性。OSIA检测方法已成功应用于赤霉素[19]、苯甲醛[20]、玉米赤霉烯酮[21]、人骨钙素[22]、双酚A[23]、11-脱氧皮质醇[24]等小分子物质的检测，最近，Dong等[25]在OSIA的基础上，采用了基于噬菌体的实时荧光定量免疫-PCR技术，进一步提高检测灵敏度，并将这种改进的方法成功应用于人骨钙素和17β-雌二醇的检测，最低检出限分别达到了0.058 ng/mL和9.8 ng/mL。Minami等[26]基于分子印迹技术和开放夹心式理论，建了一种称为开放夹心分子印迹技术（open-sandwich molecular imprinting，OS-MIP）用于检测小分子，通过表面等离子共振生物感受器监测分子的吸附和解吸。Ihara等[27]建立了一种称为Micro OS-ELISA的方法检测人骨钙素，通过OSIA与微流芯片感受器相结合，检出限达到了1 ng/mL，整个分析过程只需要12 min。

开放夹心式免疫分析自其问世以来发展迅速，开拓了非竞争检测小分子的另一个新领域。其不再受半抗原分子的大小和基团限制，既能应用于非均相又能应用均相检测，特别是均相检测（β-半乳糖苷酶的互补、荧光共振能转移及生物发光等相结合[28-32]），完全避免了反复的孵育和洗涤过程，缩短检测时间。然而只有游离的重链和轻链抗体可变区间的相互作用在抗原不存在时非常微 弱，即背景噪音很小，而抗原存在时相互作用显著增强的条件下，才能应用于此方法且抗体的性质对灵敏度的提高有很大限制，因此OSIA需要高特异性的抗体。噬菌体抗体库技术因其高库容等优点被视为制备高亲和力和特异性抗体的有效途径，同时近年来发展的分子定向改造技术也可以降低缺乏抗原时VH和VL之间的相互作用，提高检测的性噪比。

图3 开放夹心免疫检测小分子原理[33]Fig.3 Open-sandwich enzyme immunoassay for noncompetitive detection of hapten[33]

3 基于抗异型抗体及抗免疫复合物多肽

抗异型抗体（anti-metatype antibody）是针对抗原-抗体复合物中抗原与抗体之间形成的特定表位（即异型位点）产生的，所谓异型位点是由于抗原和抗体结合而引起抗体活性位点发生构象改变而形成的位点。抗异型抗体这一性质首先被Ullman等[34]用于建立了一种新的非竞争免疫分析检测四氢大麻酚，其检测过程是将抗异型抗体包被于酶标板孔，加入酶标记的抗四氢大麻酚单克隆抗体和待分析物共同孵育30 min，洗涤去除非特异性结合后加入底物液，待分析物的含量与测定的吸光度呈正比。随后，这种方法被应用于地高辛[35]、血管紧张素Ⅱ[36]和微囊藻毒素[37]的检测，检测限分别达到了30、1 pg/mL和2 pg/mL，检测快速且具有较好的精确度。

当抗原和抗体结合后，大于85%的抗原可接近表面积被包埋，只有极小部分与抗体形成异型表位，因而制备抗异型抗体特别困难。不过，Gonzalez-Sapienza等[38]研究噬菌体展示多肽库中筛选得到抗免疫复合物多肽以替代传统的抗异型抗体，并将此方法称为噬菌体抗免疫复合物分析法（phage anti-immune complex ass ay，PHAIA），见图4。该研究小组应用此方法筛选得到了抗草达灭免疫复合物多肽，并建立PHAIA用于非竞争检测草达灭，检测限为0.73 ng/mL，其灵敏度是传统竞争ELISA法的30 倍。苯氧基苯甲酸[39]和广灭灵[40]的PHAIA检测方法也先后被他们建立。此外，在PHAIA的基础上，该课题组结合实时荧光定量PCR（real-time PCR）建立了一种称为PHAIA-PCR的方法用于检测苯氧基苯甲酸和草达灭，检测限分别达到了20 pg/mL、0.2 ng/mL[41]。但是噬菌体是生物 有机体，能够感染大肠杆菌，且稳定性不如普通生物试剂，不利于实际应用。Vanrell等[42]通过化学合成抗草达灭和广灭灵抗免疫复合物多肽（称为纳米肽适配子），建立了基于纳米肽适配子的非竞争检测草达灭和广灭灵ELISA方法，最低检出限分别达到了1.2 ng/mL和3.2 ng/mL，并制备了快速检测草达灭和广灭灵的免疫试纸条。

图4 抗免疫复合物多肽筛选及检测基本原理[12]Fig.4 Schematic diagram for the selection of anti-immune complex peptides and the setting up of phage anti-immune complex assay[12]

利用噬菌体展示多肽库淘选抗抗原-抗体复合物多肽从而替代抗异型抗体是今后的一个重要发展趋势，其筛选与鉴定效率高、制备周期短，而且PHAIA的检测灵敏度高、特异性强。另外，该方法检测时无需制备检测抗原，从而避免了检测抗原的批间差异的影响和有毒小分子对操作人员的危害，是一种新的绿色免疫分析方法。

4 结 语

为了实现医学、环境和食品等中小分子物质快速、灵敏的检测，建立非竞争免疫检测方法是一种行之有效的途径，是今后发展的主要方向，我国还未见此方面的报导。建立开放夹心式免疫分析需要获得高特异性抗体，然而目前抗体体外进化技术只能改进抗体亲和力，却不能预测VH和VL之间的相互作用，如果能建立一种既能够筛选高亲和力抗体，又能测定VH与VL间的相互作用的抗体库，那将为开放夹心式免疫检测小分子物质提供关键的技术支持，已经有关于这种抗体库的研究[43]。

小分子物质和抗体结合后，小分子物质绝大部分可接近表面积被包埋在抗独特位，与抗异型抗体相比，多肽呈现更小的结合表面，因此通过淘选能更好控制多肽与抗原结合位点外的其他抗体结构的交叉反应，减小检测时的信噪比。其次PHAIA不仅适用亲水性物质[44]，而且适用疏水性物质[45]的检测，关键是取决于半抗原抗体对溶剂的耐受度，特别适合基于膜基质的现场快速检测。

膜芯片和免疫传感器能够实现高通量，多分析物同时﹑快速检测，将是今后检测方法发展的趋势。OSIA及抗免疫复合物多肽因其分子质量小，易改造以及修饰，在膜芯片和免疫传感器方面将具有更高的应用价值。

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Latest Progress on Noncompetitive Immunoassays for Small Molecules

CNEN Bo1,2, HE Qing-hua1,2, XU Yang1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Sino-Germany Joint Research Institut e, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Although competitive immunoassays are currently used more commonly to detect small molecules due to their low molecular weight and single epitope, noncompetitive immunoassays have better specificity, higher sensitivity and broader linear ranges. This review describes the latest progress on various noncompetitive immunoassays for small molecules with emphasis on their principles, characteristics and applications. Furthermore, future developmen t trends are di scussed.

noncompetitive immunoassay; haptens; specif i c antibody

TS446.6

A

1002-6630（2014）15-0310-04

10.7506/spkx1002-6630-201415061

2013-07-10

国家自然科学基金面上项目（31171696）

陈波（1987—），男，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。E-mail：nevercb@foxmail.com

*通信作者：许杨（1951—），女，教授，博士，研究方向为微生物及食品生物技术。E-mail：xuyang1951@126.com