猪圆环病毒2型感染的诊断

于 淼，何希君，于文会

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨150030；2中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨150001）

对于猪圆环病毒2型感染的诊断方法，目前有PCR技术、多重PCR、巢式PCR方法、竞争PCR方法、荧光定量PCR、原位杂交技术、DNA芯片技术等检测技术[1]。本文通过聚合酶链反应（PCR）、免疫组织化学(IHC-P)和免疫荧光（IFA）的方法，对送检病猪样本进行检测，及时发现和淘汰感染猪，减少由PCV引发的疾病，对降低养猪业的经济损失十分必要。

1 临床症状

对57例PCV-2阳性病猪的临床症状统计，消瘦、被毛粗乱是PCV-2相关疾病的主要临床表现。进行性呼吸困难、皮肤苍白也是大部分病例的临床特征。部分猪有皮炎、黄疸、下痢和嗜睡等症状。皮炎主要表现为四肢末梢，尤其是后肢有出血斑（见中插彩版图1）。

2 病理变化

对57例PCV-2阳性病例的剖检病理变化表明，所有病例都出现淋巴结病变，有不同程度的出血。肾脏出现病变，主要是肾脏肿大、有灰白色斑，部分肾脏出血。脾脏病变，表现为肿大、边缘出血，也有少部分不肿大、质地变脆。胸腹水和弥漫性肺炎也是观察到的重要病理变化，部分病例可见肝脏花斑状条纹，回肠或结肠黏膜充血、淤斑（见中插彩版图2）。

3 材料与方法

3.1 材料 PCV-2阳性病料由本实验室鉴定保存；送检病料：2013年4月-2013年10月的194份临床病料。其他常规试剂均为分析纯。

3.2 PCR检测

3.2.1 引物设计 参考GenBank中公开发表的PCV-2 ORF2的核苷酸序列，设计合成1对引物，片段跨度为整个ORF2，长751 bp。

引物序列如下：PCV-2：Cap1 5′-TTCGGTACCA GCTATGACGTATCCAAG-3′；PCV2：Cap2 5′-GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3′。

3.2.2 用于PCV-2检测的组织病料DNA的提取猪的淋巴结，加适量灭菌PBS，匀浆后，取300μL用于DNA提取。用Viral DNA/RNA Kit，根据试剂盒操作说明书提取组织总DNA。

3.2.3 PCR 总体积为30μL，包括2条PCV-2引物（10μLmol/L）各1μL，dNTP（2.5mmol/L）2.0μL，10×Buffer 3μL，Taq酶（5U/μL）0.25μL，模板DNA 3μL，加灭菌双蒸水20μL，瞬时离心混匀。PCR反应参数为94℃欲变性5min；94℃45 s，58℃45 s，72℃1min；共35个循环，最后72℃延伸10min。取8μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，以出现751 bp特异条带的样品为阳性。

3.3 免疫组织化学检测

3.3.1 材料 一抗：Anti-PCV-2 antibody(RTI公司，美国)，1∶100稀释；二抗：Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit（Sigma公司，美国），1∶100稀释。

3.3.2 方法 石蜡切片脱蜡、甲醇内处理、封闭、加一抗、二抗（含HRP标记）、DAB显色、染核、脱水透明、树胶封片。

3.4 免疫荧光检测

3.4.1 材料 一抗：anti-PCV-2 antibody（RTI公司，美国），1∶100稀释；F4/80macrophage antibody（Dako，丹麦），1∶100稀释；二抗：FITCHorse Anti-Mouse IgG monoclone antibody（Sigma，美国），1∶200稀释；Texas Red Horse Anti-Rat IgGmonoclone antibody（Vector公司，瑞士），1∶200稀释。

3.4.2 荧光染色 石蜡切片脱蜡、高压、脱脂乳封闭、添加PCV-2一抗和二抗、添加F4/80一抗和二抗、添加DAPI、封片胶封片、激光共聚焦显微镜观察。

4 结果

4.1 PCV-2PCR 检测结果来自57份样品中扩增出PCV2特异条带，与阳性对照扩增结果一致（见图3）。

图3 PCV-2 PCR扩增结果

4.2 PCV-2免疫组织化学检测结果 选取的部位是猪颌下淋巴结，其阳性信号呈黄棕色，主要位于淋巴细胞和巨噬细胞的胞浆中,偶尔出现在细胞核内和上皮细胞中（见中插彩版图4）。

4.3 PCV-2免疫荧光检测结果 选取的部位是脾脏，PCV-2阳性信号是绿色（FITC）（见中插彩版图5）。巨噬细胞阳性信号是红色（Ts Red）（见中插彩版图6）。

5 讨论

目前，PCV-2及相关疾病已在世界范围内发生并广泛流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失[2]。尽管对PCV-2的研究已经有很大的进展，但是其致病机制不是十分明确。PCV-2感染引起机体的免疫抑制，并与其他病原共同感染，加重疾病的危害性，但其具体机制尚不清楚，对于这些问题，我们都必须对病毒在体内和体外细胞中的肤质及其对免疫系统的影响、宿主的抗病病毒免疫反应及病毒蛋白对免疫功能的影响等进行深入研究[3]。

本试验使用PCR、IHC-P与IFA法检测PCV-2病毒抗原，其中IHC方法结果显示，阳性细胞主要位于感染细胞的胞质中，少数出现在细胞核内。这与唐宁等检测结果一致[4]。其中Allan等对荷兰2群猪血清学调查表明，仔猪抗PCV-2母源抗体在出生后8～9周龄消失，在12～15周龄时血清抗体重新出现，说明仔猪在11～13周龄受到PCV-2感染[5]。

PCV-2的剖检病理变化时肺脏出现非塌陷性、肝色样变区或实变，淋巴结肿大，浆膜炎，肾脏有白斑，脾脏肿大或质地变脆以及肝脏和肠道病变[6]。本试验通过PCR与IHC-P的方法，对猪圆环病毒进行快速的诊断，免疫组化结果与病理学变化和PCR检测基本相符。PCR诊断速度快，灵敏度高，成本价高，而免疫组化定位准确，成本低。免疫荧光方法可准确定位各种细胞。在临床诊断中，如果只是对疾病确诊，只需要采用PCR的方法。而如果想确定病毒感染的部位需要免疫组织化学的方法。如果要进一步确定圆环病毒感染何种细胞，需要采取免疫荧光的方法。

[3] 娄忠子.猪圆环病毒的分子生物学研究进展[J].中国兽医学报，2010，30（6）：862-868.

[4] Kekarainen T，Montoya M，Dominguez J，et al.Porcine circovirus type2（PCV2）viral components immunomodulate recall antigen responses[J].Vet Immunol Immunopathol，2008，124（1-2）：41-49.

[5] 王李辉，赵明军.猪免疫抑制性疾病致病机制研究进展[J].猪业科学，2010，4：80-83.

[6]免疫组化法检测猪圆环病毒2型在人工感染猪体内的分布[J].畜牧兽医学报，2008，39（3）：372-375.

[7]Allan GM，Ellis JA.Porcine circoviruses：a review[J].JVet Diagn Invest，2000，12：3-14.

[8]Rosell C，Segal J，Plana-Dur J，et al.Pathological,immunohistochemical，and in situ hybridization studies of natural cases of post weaningmultisystemic wasting syndrome（PMWS）in pigs[J].JComp Pathol，1999，120：59-78.