重庆某牛场乳房炎病原菌分离鉴定及药物敏感试验

周文君，孙裕光，沙 莎

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌402460）

乳房炎是由于病原微生物侵入奶牛乳腺组织所引起的一种严重危害奶牛业发展的常见病、多发病。主要引起乳房炎的致病菌已报道约80多种，如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、微球菌等。环境的微生物也是引起牛乳房炎的另一致病因素，如肺炎克雷伯菌、假单胞菌等革兰阴性病原菌等[1]。抗生素为临床治疗牛乳房炎的首选药物，但因抗生素导致的耐药性给乳房炎的治疗带来很大的困难，在对乳房炎药物治疗过程中的药物残留也成为牛奶品质和牛乳食品安全的一大隐患。本试验对该牛场患乳房炎奶牛的乳汁进行病原菌分离鉴定以及药敏试验，以期获得患病牛乳的细菌种类和敏感药物或耐药菌株存在状况。

1 材料与方法

1.1 样品采集 样品为重庆市某奶牛场患临床型或亚临床型乳房炎牛奶，如乳房红、肿，部分乳房出现萎缩或硬块；表现产奶量下降症状的病牛。每头病牛采集的牛乳样品为1份：采样前消毒乳房及4个乳区，各乳区采乳约10mL，盛于灭菌烧瓶中。共采10头牛，10份样品混合，暂保存于4℃的冰箱，72 h内进行细菌分离，获得菌株。

1.2 培养基及主要试剂营养琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、普通肉汤等按常规方法制作。麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、生化鉴定所用的微量发酵管，购自杭州天和微生物试剂有限公司，批号：20120301，20120111。红霉素、恩诺沙星、氨苄青霉素、链霉素、头孢噻吩、乙酰螺旋霉素、阿莫西林、氟哌酸、磺胺异恶唑等试验用药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司生产，批号：110817。

1.3 试验动物 昆明系小鼠60只，购自泸州医学院实验动物中心，养1周后用于致病性试验。

1.4 方法

1.4.1 细菌分离培养及计数 无菌操作，取10-1稀释乳样0.2mL，用“L”棒涂布于鲜血琼脂培养基上，37℃恒温培养24～48 h。进行菌落计数，挑取培养基上的不同生长特征的菌落进行纯化，将纯培养物编号保存，置4℃备用。

1.4.2 分离菌形态学及培养特性观察 将已纯化菌株进行革兰染色镜检，并观察菌落生长特性及在不同基质上生长状况。

1.4.3 分离菌生化鉴定 按细菌编码鉴程序对分离纯化的细菌分别进行生化鉴定：G-、氧化酶试验阴性菌直接用肠杆菌科细菌编码鉴定。G-、氧化酶试验阳性、O／F试验阳性菌通过厌氧葡萄糖试验即可进行弧菌科生化编码鉴定。G+球菌通过触酶、葡萄糖发酵、玻片凝固酶、试管凝固酶、新生霉素试验、动力和溶血试验鉴定；试验结果根据伯杰细菌鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册判定细菌种类。部分G+杆菌使用BIOFOSUNGP48板条用BIOFOSUN微生物鉴定系统（上海复星佰珞生物技术有限公司）鉴定。

1.4.4 分离菌致病性试验 将60只小鼠随机分成12组[2]，11组做试验组，1组做对照组，每组5只，隔离饲养。将分离的11株菌的24h肉汤培养物对小鼠进行腹腔注射0.2mL/只（1.5×109/mL），对照组注射灭菌生理盐水0.2 mL/只。观察记录小鼠的存活情况。死亡者剖检观察病变并进行细菌分离鉴定。

1.4.5 致病菌药敏试验 用引起小鼠死亡的菌株和常用抗生素药纸片，按纸片扩散法（Kirby-Baueer Dise Diffusion）进行试验。37℃恒温培养24～48 h，测量抑菌圈的直径，以CLSI的判定标准判定结果。

2 结果

2.1 样本细菌分离培养和计数 患乳房炎的乳汁样本中平均细菌总数1.42×103CFU/mL，少于国家卫生标准GB 19301-2010鲜牛标准（2×106CFU/mL）。从中分离到11株细菌进行鉴定。

2.2 分离菌形态学及生化鉴定 样本中11株细菌，经形态学和生化鉴定有8种菌：YR-1、YR-3、YR-7为嗜水气单胞菌，占分离菌27.3%；YR-2、YR-5为微球菌，占分离菌18.2%；YR-4为鲍曼不动杆菌，占分离菌9.1%；YR-6为表皮葡萄球菌，占分离菌9.1%；YR-8为枯草杆菌，占分离菌9.1%；YR-9为温和气单胞菌，占分离菌9.1%；YR-10为克里斯坦森耶尔森氏菌，占分离菌9.1%；YR-11为海鱼弧菌，占分离菌9.1%。鲜血琼脂培养基上鲍曼不动杆菌(YR-4)呈β溶血，枯草杆菌（YR-8）呈α溶血。

2.3 分离菌致病性试验 样本中8种细菌，有5种菌具有致病性，分别是表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌、枯草杆菌和微球菌，致病菌的检出率为54.5%。其中表皮葡萄球菌和嗜水气单胞菌致病力最强，试验小鼠100%死亡，微球菌、鲍曼不动杆菌和枯草杆菌使试验小鼠80%死亡，死亡小鼠均出现不同程度的败血症症状；对病死小白鼠的脏器分离培养鉴定，均回收到原菌。另外克里斯坦森耶尔森氏菌、海鱼弧菌、温和气单胞菌接种的小鼠未出现死亡。对照组小鼠未见不良症状。

2.4 药敏试验 选用链霉素、诺氟沙星等9种常用药物和5种致病性菌作药敏试验。结果（见表1）：嗜水气单胞菌对氨苄青霉素、头孢噻吩药物耐药，枯草杆菌对氨苄青霉素、头孢噻吩、阿莫西林和磺胺药物耐药。其他的菌株对这9种药物均敏感。

表1 药敏试验结果 （株）

3 分析与讨论

该奶牛场是重庆市某奶牛产业链中奶牛养殖环节中的一个，由各个奶牛养殖场组成的养殖集团生产鲜乳，鲜奶的质量和产量至关重要，了解牛养殖场奶牛乳房炎基本状况可以为科学养殖管理提供科学依据。

样本细菌总数的结果少于国家卫生标准其原因或是使用抗生素药物治疗乳房炎的缘故。在样本中分离鉴定出8种11株菌，其中嗜水气单胞菌、微球菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和枯草杆菌5种菌对小白鼠有致病性。从细菌的种类上比较，该牛场致病菌种类与文献报道[1-8]结果略有不同，其中鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌在乳房炎病例中少有报道。表皮葡萄球菌和嗜水气单胞菌致病力最强，可使试验小白鼠100%死亡，是引发该奶牛场乳房炎的主要病原。鲍曼不动杆菌是医院内感染常见致病菌之一，为条件致病菌[6]。枯草杆菌在通常情况下为非致病菌，但某些情况下枯草杆菌亦可导致人体感染[7]。此时在乳房炎牛乳中发现并使试验小鼠80%死亡，说明鲍曼不动杆菌和枯草杆菌是主要的致病因素之一。嗜水气单胞菌在样本中分离出说明牛场环境有嗜水气单胞菌污染，环境条件恶劣，牛体抵抗力低下时，可造成乳房炎的发生。样本中有微球菌的结果与报道同[8]。此外在乳样中还有克里斯坦森耶尔森氏菌、海鱼弧菌、温和气单胞等条件致病菌[10]，虽检出率均低为10%,并且未引起小鼠死亡，但这些菌的生存条件是湿热环境；牛舍环境潮湿为致病菌和条件致病菌提供温床。当动物机体的抵抗力下降，使动物感染疾病的机率增加，牛乳房炎亦是如此。

临床上抗生素为治疗牛乳房炎的首选药物，试验结果显示嗜水气单胞菌对氨苄青霉素、头孢噻吩药物耐药，枯草杆菌对氨苄青霉素、头孢噻吩、阿莫西林和磺胺药物耐药。其中氨苄青霉素、头孢噻吩药物为广谱抗菌药，常用于临床用药，嗜水气单胞菌对产生耐药的原因可能不仅仅是因为临床的滥用，也可能是因为嗜水气单胞菌能产生β-内酰胺酶降解青霉素有关[8]。在临床治疗时应避免选择已产生耐药的氨苄青霉素、头孢噻吩等药物，而链霉素和氟哌酸等药物对该牛场致病菌有较好的抑菌效果。另外红霉素为大环内酯类抗生素[5]，对部分革兰阴性菌有抑菌作用，鲍曼不动杆菌在结果中显示对红霉素敏感，这一结果少有报道，或可为鲍曼不动杆菌研究和大环内酯类抗生素抗菌研究提供素材。

综上所述，试验研究证明该牛舍环境潮湿，饲养状况差是该牛场存在的问题之一，在对乳房炎进行治疗时，除了使用抗菌敏感药物外，还应全方位改善饲养环境，定期对牛群排查、治疗，及时消除潜在的隐患，以减少奶牛乳房炎带来的经济损失。

[1]冯万字，史同瑞，许腊梅.奶牛乳房炎的诊断与防制研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2008（4）：79.

[2] 万霞，刘建平.临床试验中的随机分组方法[J].中医杂志，2007，48（3）：216-219.

[3]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京：中国农业出版社，2002，19-66.

[4] 张福臣.牛乳房炎的危害及防治[J].畜牧兽医科技信息，2010（4）：65.

[5]郑忠辉，石和鹏，等.大环内脂抗生素的发展与展望[J].药学进展，2005，29（1）：2.

[6]徐秀华.临床医院感染学[M].长沙：湖南科学技术出版社，1998：308-309.

[7]史凯.新生儿枯草杯菌败血症33例临床分祈[J].临床儿科杂志，1992，6：400-401.

[8]Bakken JS，Sanders C C，Clark R B，et al.β-lactam resistance in Aeromonas Spp.caused by induciblelβ-lactamases active against penicillins,cephalosporins andβ-lactamases active against penicillins,cephalosporins and carbapenems[J].Antimicrob Agents Chemother，1998，32（9）：1314-1319.

[9]Major causes ofmastitis and associated risk factors in smallholder dairy cows in Shashemene,southern Ethiopia African Journal of Agricultural Research 1991-637X，Volume 26Jun，Issue 26Jun，2012，Pages 3513-3518.

[10]R E布坎南.伯杰细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，1984.