牙周炎龈沟液中HMGB1、2的表达及意义*

韩永刚陈忠寿黄风云

牙周炎龈沟液中HMGB1、2的表达及意义*

韩永刚①陈忠寿①黄风云①

目的：探讨HMGB1、HMGB2与NO在牙周炎发病中的相关性，以了解HMGB1、HMGB2在牙周炎发病中可能的生物学作用。方法：选取2012年3月-2014年3月本院牙科收治的106例牙周炎患者作为试验组，另外选取本院牙齿健康体检者58例作为对照组。应用酶联免疫吸附测定HMGB1、HMGB2及硝酸还原法测定NO在龈沟液中的含量，分析HMGB1、HMGB2与NO在牙周炎龈沟液中的相关性。结果：两组HMGB1、HMGB2和NO三个指标的比较差异均有统计学意义（P＜0.05），表示HMGB1、HMGB2和NO三个指标在牙周炎龈沟液中的表达与正常人比较异常增高。HMGB1和HMGB2与NO的水平作Spearman相关分析，相关系数分别为r=0.875、0.848（P＜0.05），均呈正相关。结论：HMGB1、HMGB2可能是牙周炎中的重要炎因子之一。

牙周炎； 龈沟液； 高迁移率蛋白； 一氧化氮

牙周炎是患者牙周部位受到感染时，机体免疫系统产生抗感染作用时导致牙周炎症介质及毒性自由基聚集所引起的一系列炎症感染症状。牙周炎通常为慢性炎症逐渐发展为急性炎症，也就是牙周炎的活跃期[1-2]。牙周炎可侵犯牙周组织，造成炎症破坏性疾病，主要为牙周袋及袋壁的炎症，从而导致牙槽骨吸收及牙齿逐渐松动甚至脱落，牙周炎是导致成年人缺牙的主要原因，其主要的炎症反应是过度的机体免疫反应所造成的自我破坏[3-4]。研究牙周炎的炎症因子HMGB1、HMGB2与NO发病中的作用有重要的意义。故本文通过ELISA检测牙周炎患者龈沟液中HMGB1、HMGB2与NO的表达量，可通过相关回归曲线分析它们的关系，了解其与牙周炎发病进展中可能存在的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年3月-2014年3月本院牙科收治的106例牙周炎患者作为试验组，患者牙颈部无龋损、无充填体，平均年龄（42±12）岁。另外选取本院牙齿健康体检者58例作为对照组，所有体检者均为未发生过牙周疾病人群，平均年龄（24±5）岁，不吸烟，未妊娠，至少1个月内未使用过抗生素及非甾体抗炎药或者其他影响白细胞的药物，与其签署知情同意书。

1.2 实验标本 每2 mm×10 mm滤纸条放入一个微离心管中进行消毒干燥，在电子天平上称重并记录备用。去除龈沟液收集部分的龈上菌斑，棉球隔湿后气枪轻吹待测牙面，1 min后将滤纸条插入患牙的观察位点的龈沟，当有阻力时停止，滞留30 s后取出，放入Ep管立即称重并与收集龈沟液前重量比较，算出龈沟液的重量（mg），按龈沟液密度等于1计算龈沟液量（mL）。在Ep管中加磷酸盐缓冲液300 μL，震荡1 h后取出滤纸条，将标本放入-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 方法

1.3.1 主要仪器 -20 ℃普通冰箱，离心机（深圳爱特尔），全自动酶标仪（Bio-Tec）。

1.3.2 主 要 试 剂 HMGB1/HMG3/SBP-1/HMG1 （HMGB1）Elisa试剂盒购自江苏省弗泰生物科技有限公司，货号：HMGB2/HMGB（HMGB1）Elisa试剂盒购自江苏省弗泰生物科技有限公司，货号：HD-HMGB2；一氧化氮Griess Reagent法检测试剂盒（NO）（货号：S0021，公司：碧云天）。

1.3.3 ELISA检测HMGB1和HMGB2在牙周炎龈沟液中的表达水平 96孔板第一排的8个孔作为标准孔，按以下浓度：1、5、10、20、30、40、50 μL滴入各标准孔，按50 μL/孔稀释，第1排的最后一个孔滴入超纯水作为空白对照，利用标准孔数据在Excel下建立标准曲线。将制备的龈沟液回复常温后各样品50 μL加入其余样品孔，在37 ℃的恒温箱中反应90 min；预先制备的0.01 M PBS洗板3次，滤纸印干；加入一抗（HMGB1和HMGB2）100 μL，37 ℃恒温箱中反应60 min；0.01 M PBS再次洗板3次，每次浸泡4 min，滤纸印干；加入酶标液100 μL，37 ℃恒温箱中反应30 min；0.01 M PBS洗板4次，每次浸泡3 min，滤纸印干；加入底物TMB 90 μL，置恒温箱中37 ℃在暗处反应11 min；每孔加入1滴终止液混匀，当蓝色转为黄色时上机检测；酶标仪设定450 nm处测定吸光值。

1.3.4 龈沟液中一氧化氮的检测 取出标准品（1 M NaNO2）和样品（龈沟液）放置至室温；将标准品按以下浓度加入标准孔：0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、80、100 μM，并稀释至50 μL/孔。在剩余的样品孔中加入50 μL/孔的关节液样品；取出Griess Reagent Ⅰ、Ⅱ放置至室温，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅱ；通过酶标仪测出各标准品及样品孔的吸光度，通过标准品的吸光度绘制出标准曲线，并通过标准曲线及样品孔的吸光度求出各样品的NO浓度。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，其中两组3个指标组间比较应用单因素方差分析；作HMGB1和HMGB2与NO进行Spearman相关分析，检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组HMGB1、HMGB2及NO的比较 两组HMGB1、HMGB2及NO组间比较作单因素方差分析，两组HMGB1、HMGB2及NO的比较差异均有统计学意义（P＜0.05），表示HMGB1、HMGB2及NO在牙周炎龈沟液中表达与正常人的龈沟液比较异常增高（P＜0.05），见表1。

2.2 CCL1与HMGB2和NO的相关分析 HMGB1与NO水平作Spearman相关分析，相关系数为r=0.875 （P＜0.05），两者呈正相关。HMGB2与NO水平作Spearman相关分析，相关系数为r=0.848（P＜0.05），两者呈正相关。

表1 两组HMGB1、HMGB2及NO的比较（±s）

表1 两组HMGB1、HMGB2及NO的比较（±s）

*与对照组比较，P＜0.05

NO （μmol/L）试验组（n=106）784.94±210.13*824.11±172.72*185.52±55.79*对照组（n=58）126.86±75.53 110.73±53.38 27.33±19.35组别 HMGB1 （pg/mL）HMGB2 （pg/mL）

3 讨论

牙周炎发病原因是由于牙周的龈沟液中炎症因子的聚集与形成紧密相关。正常口腔中产生的NO是由L-精氨酸在一氧化氮合酶的催化下生成L-瓜氨酸时释放的。一些研究已证实NO对维持口腔内正常菌群的平衡以及抗微生物感染有直接影响[5-6]。同时，适量的NO对牙周组织的健康及功能的正常发挥起着重要作用[7-8]。在牙周炎症状态下，血管内皮素的含量显著增高，NO的水平相应增高来对抗血管内皮素所造成的牙周组织小血管及微血管的强烈收缩，在此防御反应过程中，过量产生的NO使扩血管因子与缩血管因子之间的关系失衡，通过活化多重级联信号引发炎症级联瀑布反应，促进炎症发展[9-10]。因此NO在牙周炎发病过程中的炎症作用已不言而喻。然而牙周炎的龈沟液中的炎症改变是否与HMGB1、HMGB2的炎症聚集有关？定量检测牙周炎患者的龈沟液中HMGB1、HMGB2的含量是否可以作为牙周炎的诊断指标？目前为止尚未有报道肯定的回答以上两个问题，以下将对以上两个问题展开深入讨论。

本实验的研究证明，HMGB1、HMGB2及NO在牙周炎患者的龈沟液中表达较正常患者增高，可以说明HMGB1、HMGB2及NO均为牙周炎的炎症因子之一，与其他报道结果基本相符[11-13]。从实验数据上可发现，试验组龈沟液中HMGB1、HMGB2及NO的表达数据均明显高于对照组，更进一步的说明了HMGB1、HMGB2及NO与牙周炎的发病密切相关。对于健康人群的牙周龈沟液的检测中可看出HMGB1、HMGB2 及NO的表达量相对较低，从过去的报道中可知[14-15]。这表明可能在低含量的HMGB1、HMGB2及NO情况下不会形成牙周炎。

由上述可知，NO因浓度不同而具有不同的生物学作用，低浓度时可扩血管、抗菌的作用，可促进口腔健康，而高浓度时可促牙周炎症形成及牙周组织破坏的作用。本研究发现HMGB1和HMGB2与NO均成正相关关系，由此可表明HMGB1和HMGB2均可促进KOA的局部炎症形成，进而可能参与牙周组织的破坏。

综上所述，HMGB1和HMGB2可能是炎症因子NO的协同作用因子，其可促进牙周局部炎症形成。探讨HMGB1和HMGB2拮抗剂进一步地了解HMGB1和HMGB2在牙周炎中的作用机制，更能为临床治疗牙周炎提供新的靶向治疗方向。

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Expression and Significance of HMGB1，2 of the Gingival Crevicular Fluid of Periodontitis

/HAN Yonggang，CHEN Zhong-shou，HUANG Feng-yun.//Medical Innovation of China，2014，11（21）：083-085

Objective：To investigate the correlation between HMGB1， HMGB2 and NO in the onset of periodontitis，to understand the possible biological role of HMGB1，HMGB2 in the pathogenesis of periodontitis.Method：160 patients with periodontitis in dental department from March 2012 to March 2014 were selected as the experimental group，in addition teeth healthy subjects in our hospital were selected as the control group.Enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the expression of HMGB1，HMGB2 and NO in gingival crevicular fluid.The correlation of HMGB1，HMGB2 and NO were analyzed in the periodontitis of gingival crevicular fluid.Result：The experimental group compared with the control group had statistical significance in the HMGB1，HMGB2 and NO（P＜0.05）.It showed that HMGB1，HMGB2 and NO expression in periodontitis gingival crevicular fluid compared with normal people in gingival crevicular fluid were abnormal increased.Spearman correlation analyzed for the expression levels of HMGB1，HMGB2 and NO.The correlation coefficients were r=0.875，0.848（P＜0.05），positived correlation.Conclusion：HMGB1，HMGB2 is one of important inflammatory factors in periodontitis.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.027

2014-04-11） （本文编辑：欧丽）

2012年深圳市龙岗区科技项目（YS2013189）

①广东省深圳市龙岗区南湾人民医院 广东 深圳 518114

韩永刚

【Key words】Periodontitis； Gingival crevicular fluid； High mobility protein； Nitric oxide

First-author’s address：Nanwan People’s Hospital of Longgang District in Shenzhen City，Shenzhen 518114，China