去脂软肝方对高脂诱导大鼠脂肪肝血管性血友病因子作用的实验研究

卞 瑶 黄文俊 姚 政 石安华 施钦柔 殷 华 陈文慧

云南中医学院，云南昆明650500

去脂软肝方对高脂诱导大鼠脂肪肝血管性血友病因子作用的实验研究

卞 瑶 黄文俊 姚 政 石安华 施钦柔 殷 华 陈文慧

云南中医学院，云南昆明650500

目的探讨去脂软肝方对高脂诱导脂肪肝大鼠肝组织血管性血友病因子的影响作用。方法高脂饮食复制大鼠脂肪肝模型，将实验鼠随机分为三组：正常组，模型组，去脂软肝方组。去脂软肝方组予去脂软肝方药液灌胃（1 mL/200 g）共12周；HE染色观察肝脏脂肪变性情况；测定大鼠血清血脂、肝脂、血浆血小板聚集率及肝组织血管性血友病因子（vWF）。结果12周末模型组大鼠血脂[血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）]水平比正常组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠肝组织匀浆（肝脏TC、TG）与比正常组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；去脂软肝方组血清脂质和肝组织脂质水平比模型组低，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠血小板聚集率比正常组高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；模型组大鼠肝脏组织中vWF比正常组高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；去脂软肝方组血浆血小板聚集率变化及肝组织vWF比模型组低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。结论去脂软肝方能明显改善高脂诱导脂肪肝大鼠血脂、肝脂及肝组织脂肪变性。减少vWF分泌、抑制血小板聚集、减轻血管及肝窦内皮细胞损伤可能是其作用机制之一。

去脂软肝方；高脂；脂肪肝；大鼠；血管性血友病因子

近年来，随着社会的发展，生活水平提高，我国患脂肪肝人群数量逐年递增，部分脂肪肝如果迁延不愈，可进展为肝纤维化甚至肝硬化[1]。因此，如何在早期阻止脂肪肝的进一步发展是目前研究的关键。课题组前期对云南省荣誉名中医、著名中西医结合肝病专家苏涟教授以“辨病为主，从瘀而治”思路拟定的“去脂软肝方”进行研究，证实该方具有较好的改善高脂诱导脂肪肝血脂、肝脂肝及肝组织脂肪变性作用[2-6]。但其作用机制及关键环节尚不完全清楚。本研究采用高脂诱导非酒精性脂肪肝大鼠，观察脂肪肝大鼠模型与血瘀证、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）关系，探讨去脂软肝方治疗脂肪肝的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠30只，体重（100±10）g，清洁级。购自四川省医学科学院实验动物研究所，许可证号：SCXK（川）2010-16，云南中医学院（以下简称“我院”）动物房饲养，造模及观察。

1.2 药品及主要试剂

去脂软肝方三七1 g、山楂15 g、菊花10 g、白术15 g、青皮6 g、莪术15 g等七味中药）购自我院门诊部药房，由我院中药制剂室制成流浸膏（含生药1.44 g/mL）；胆固醇（Cholesterol）分析纯，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；猪油，购自昆明沃尔玛超市，生产日期：20110326；大鼠vWF ELISA检测试剂盒（美国R&D公司），批号20110401A：购自昆明晨绿生物科技开发有限公司。

1.3 造模方法

将大鼠分为正常组10只，高脂饮食造模组20只，正常组大鼠每天予以标准大鼠饲料喂养，造模组大鼠每天予以高脂饲料（88%普通饲料基础上加10%猪油，2%胆固醇）喂养，连续12周，均自由饮水。

1.4 分组及给药

自造模之日起，高脂饮食造模组20只，随机分为模型组10只和去脂软肝方组10只；正常组和模型组给予生理盐水灌胃（1 mL/200 g，每日），去脂软肝方组按去脂软肝方药液灌胃（1 mL/200 g，每日），连续12周。

1.5 观察指标

1.6 统计学方法

采用SPSS17.0软件包进行统计学处理，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝组织HE染色

HE染色显示正常组大鼠肝组织结构清晰、完整，肝小叶形态结构正常，肝细胞大小均匀，胞圆形，呈条索状排列，可见中央静脉。模型组大鼠肝细胞明显肿大，呈黄色，切面油腻，中央静脉周围脂肪病变明显，体积较正常明显增加，可见超过2/3的肝细胞胞浆中出现大小不一的圆形脂滴空泡，有的空泡融合将细胞核挤向胞膜下，可见肝细胞肿大，胞浆疏松呈网状、半透明（胞浆疏松化），严重者胞浆几乎完全透明（气球样变）；去脂软肝方组可见一定量的肝细胞胞浆中出现大小不一的圆形脂滴空泡。

2.2 去脂软肝方对高脂饲料致脂肪肝模型大鼠血清脂质和肝组织脂质变化的影响

模型组大鼠血脂（血清TC、TG）与比正常组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠肝组织匀浆（肝脏TC、TG）与比正常组高，差异有统计学意义（P＜0.05）；去脂软肝方组血清脂质和肝组织脂质比模型组低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 去脂软肝方对脂肪肝大鼠血清脂质和肝组织脂质变化的影响（mmol/L，x±s）

2.3 去脂软肝方对高脂饲料致脂肪肝模型大鼠血浆血小板聚集率变化及肝组织血管性血友病因子的影响

模型组大鼠血小板聚集率比正常组高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；模型组大鼠肝脏组织中血管性血友病因子比正常组高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；去脂软肝方组血浆血小板聚集率变化及肝组织血管性血友病因子比模型组低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 去脂软肝方对脂肪肝大鼠血小板聚集率及肝组织血管性血友病因子的影响（x±s）

3 讨论

本研究采用改良高脂饲料即88%普通饲料+10%猪油+2%胆固醇复制大鼠脂肪肝模型，12周末HE染色显示模型组大鼠肝细胞明显肿大，呈黄色，切面油腻，中央静脉周围脂肪病变明显，体积较正常明显增加，可见超过2/3的肝细胞胞浆中出现大小不一的圆形脂滴空泡，有的空泡融合将细胞核挤向胞膜下，可见肝细胞肿大，胞浆疏松呈网状、半透明（胞浆疏松化），严重者胞浆几乎完全透明（气球样变），同时，大鼠血清与肝组织匀浆检测TC、TG均有不同程度的增高，出现典型脂肪肝大鼠模型。

目前脂肪肝的发病机制尚不完全清楚，有研究表明脂肪肝患者大多存在高血脂及微循环障碍的改变[6]，一方面血脂升高、脂质过氧化反应加剧能够促进血小板高聚集率，发生血小板活化[7-8]；另一方面血小板活化，进一步引起血液高凝状态的出现，血液黏度增高，血液循环阻力升高，加重微循环障碍，从而加重血管内皮损伤、肝细胞损伤，导致脂肪肝病变发展。

vWF是血管内皮细胞受损的重要标志物，通过测定vWF的水平可以判定患者内皮细胞损伤的慢性或急性阶段[9]。vWF是介导血小板与血管内皮下组织黏附的主要分子，目前已知它能参与血小板-血管壁，血小板-血小板之间的相互作用，在血小板活化、血液凝固中发挥重要作用[10]，有研究表明，vWF在肝脏损伤和修复过程中发挥积极作用，肝组织中vWF可沿肝窦的表达使肝窦内血流处于血栓前状态，易于形成微血栓，导致微循环障碍，肝脏微循环障碍可以影响相应供血区域肝细胞的营养状况，造成肝细胞缺血缺氧[11]。有学者也认为vWF升高与肝脏血管内皮损害程度成正比，可以作为反映肝脏血管内皮损害的一个非特异性指标[12-13]。

本实验中发现，12周末模型大鼠血清与肝组织匀浆检测TC、TG均有不同程度的增高的同时，血浆血小板聚集率升高，肝组织vWF分泌增多，且与正常组比差异有统计学意义（P＜0.05），表明肝组织vWF因子分泌增多，血小板聚集率增加，发生血小板活化，加重微循环障碍，从而影响到肝窦内皮细胞（LSEC）。表明脂肪肝模型大鼠与vWF、血小板聚集率、血小板活化及肝窦内皮细胞损伤之间有一定关联。

云南著名中西医结合肝病专家苏涟教授对早期脂肪肝提出“肝郁脾虚，虚瘀交结”病理特点，并从多年临床用药经验中，反复筛选组成以三七、莪术、赤芍等活血化瘀为主的“去脂脂软肝方”方药治疗脂肪肝取得明显的临床疗效。从脂质代谢的各个环节进行多项药效学研究发现其对高脂饲料所致的高血脂、肝脂有降低作用，同时还能明显降低停饲高脂饲料后大鼠的肝脂、血脂水平，表明其不仅能抑制脂质的吸收，还能促进脂质的降解。本研究与以往研究结果相一致[2-6]。因此脂肪肝的中医治疗从瘀而治，有临床及药理研究的支持，血小板活化是血瘀证产生的重要病理生理基础，运用活血化瘀为主方药可以抑制血小板聚集，减少血小板活化，从而改善肝脏微循环障碍，减轻脂肪肝病变发展。本研究结果表明以活血化瘀为主的“去脂脂软肝方”可能是通过减少vWF分泌抑制血小板聚集，减少血小板活化，减轻血管及肝窦内皮细胞损伤途径来实现的。

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Experimental research of Quzhi Ruan'gan Prescription in effect of von Willebrand factor in rats with fatty liver caused by high fat

BIAN YaoHUANG WenjunYAO ZhengSHI AnhuaSHI QinrouYIN HuaCHEN Wenhui
Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Yunnan Province,Kunming650500,China

Objective To investigate the impact of Quzhi Ruan'gan Prescription in von Willebrand factor(vWF)of rats with fatty liver caused by high fat.Methods The model of rats with fatty liver was made by high fat diet,and the model rats were randomized to 3 groups:normal group,model group and Quzhi Ruan'gan Prescription group.Quzhi Ruan'gan Prescription group was treated with gavage of Quzhi Ruan'gan Prescription(1 mL/200 g)for 12 weeks.The condition of fatty degeneration of liver was observed with HE staining.The serum lipid,liver lipid,the rate of serum platelet aggregation and vWF in liver tissue were tested.Results At the end of 12th weekend,the levels of serum lipid(TC,TG)in model group were higher than those in normal group,the differences were statistically significant(P＜0.05);the levels of serum lipid and liver lipid in Quzhi Ruan'gan Prescription group were lower than those in model group(P＜0.05); the rate of serum platelet aggregation in the model group was higher than that of normal group,the difference was highly statistically significant(P＜0.01);the vWF in liver tissue in the model group was higher than that of normal group, the difference was highly statistically significant(P＜0.01);the rate of serum platelet aggregation and vWF in liver tissue of Quzhi Ruan'gan Prescription group were lower than those in model group,the differences were highly statistically significant(P＜0.01).Conclusion Quzhi Ruan'gan Prescription can improve the conditions of high fat resulting in serum lipid,liver lipid and liver fatty degeneration of rats with fatty liver obviously.One of the mechanism may be associated with reduction of the secretion of vWF,inhibition of platelet aggregation,lightening the damage of blood vessel and liver sinusoidal endothelial cell.

Quzhi Ruan'gan Prescription;High fat;Fatty liver;Rats;Von Willebrand factor

R575.2

A

1673-7210（2014）01（a）-0004-03

2013-09-03本文编辑：张瑜杰）

国家自然科学基金资助项目（编号81160492）。

卞瑶（1964.7-），女，江苏句容人，副教授，云南中医学院继职学院院长，长期从事生物化学的理论及实验教学进行物质代谢的基础研究。

陈文慧（1963.10-），女，广东兴宁人，教授，云南中医学院基础医学院副院长，长期从事温病学、中西医结合基础的教学及科研工作。